دانلود پایان نامه:ارزیابی اثر عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر تکثیر فیبروبلاست و فعال شدن مسیر پیام رسانی Smad

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست‌شناسی

گرایش :سلولی و مولکولی

عنوان : ارزیابی اثر عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر تکثیر فیبروبلاست و فعال شدن مسیر پیام رسانی92 Smad

دانشکده علوم پایه و فناوری‌های نوین زیستی

گروه زیست‌شناسی سلولی و مولکولی

پایان نامه کارشناسی ارشد زیست‌شناسی سلولی و مولکولی

 

ارزیابی اثر عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر تکثیر فیبروبلاست و فعال شدن مسیر پیام رسانی Smad

استاد راهنما

دکتر مرضیه ابراهیمی

 

استاد مشاور

دکتر ناصر اقدمی

 

بهمن ۱۳۹۲

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)فهرست مطالبعنوان                صفحهمقدمه. 1فصل اول کلیات.. 11-1 تعریف زخم و انواع آن. 2۱-۲ سوختگی.. 2۱-۳ زخم بستر. 2۱-۴ ترمیم زخم. 3۱-۵ التهاب.. 4۱-۶ شکل‌گیری بافت.. 5۱-۷ بلوغ و بازسازی بافت.. 6۱-۸ روش‌های درمانی برای تسریع و بهبود فرایند ترمیم زخم. 6۱-۹ پلاکت و نقش آن درروند ترمیمی زخم. 7۱-۱۰ ساختمان و عملکرد پلاکت‌ها 8۱-۱۱ مزایای استفاده از خون‌بند ناف.. 11۱-۱۲ مزیت فرآورده‌های پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف نسبت به خون محیطی.. 12۱-۱۳ انواع محصولات مشتق از پلاکت.. 12۱-۱۴ پلاسمای غنی از پلاکت.. 12۱-۱۵ ژل پلاکتی.. 13۱-۱۶ عصاره پلاکتی.. 14۱-۱۷ تأثیرات عصاره پلاکتی روی ترمیم زخم. 14۱-۱۸ فاکتورهای رشد و مسیر سیگنالینگ اختصاصی‌شان. 19۱-۱۹ فاکتور رشد رگ زایی.. 20۱-۲۰ فاکتور رشد اپیدرمی.. 21۱-۲۱ فاکتور رشد مشتق از پلاکت.. 22۱-۲۲ فاکتور رشد تراریختی.. 24۱-۲۳ اهداف طرح: 26فصل دوم مواد و روش‌ها 27۲-۱ مواد، وسایل و دستگاه‌های موردنیاز برای آزمایش‌ها به شرح زیر است: 28۲-۲ کشت و پاساژ رده سلول‌های فیبروبلاست انسانی.. 30۲-۲-۱ رده سلولی موردمطالعه. 30۲-۲-۲ آماده‌سازی محیط کشت سلولی.. 30۲-۲-۳ پاساژ سلولی.. 31۲-۲-۴ شمارش سلولی.. 32۲-۲-۵ انجماد و ذخیره‌سازی سلول‌ها 33۲-۲-۶ ذوب کردن سلول‌های منجمد شده. 33۲-۲-۷ تهیه فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف.. 34۲-۳ بررسی اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر (فیبروبلاست) 35۲-۴ بررسی اثر فرآورده عصاره پلاکتی بر درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست.. 36۲-۵ اندازه‌گیری میزان مهاجرت سلولی به روش  assay Scratch. 36۲-۶ فرمول بکار رفته در تست خراشیدگی.. 37۲-۷ بررسی بیان ژن. 37۲-۷-۱ مراحل استخراج RNA.. 38۲-۷-۲ تیمار RNA با DNAaseІ. 40۲-۷-۳ تعیین جذب نوری و غلظت نمونه‌های RNA.. 40۲-۷-۴ الکتروفورز، رنگ‌آمیزی و مشاهده RNA بر روی ژل آگارز. 40۲-۷-۵ سنتز cDNA.. 42۲-۷-۶ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 43۲-۷-7 پرایمر. 43۲-۷-8 نحوه رقیق کردن پرایمر. 43۲-۷-9 Real time PCR. 44۲-۸ جمع‌آوری عصاره سلولی.. 46۲-۸-۱ تعیین غلظت پروتئین‌ها به روش بردفورد. 46۲-۸-۲ انجام تست وسترن بلات به‌منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین‌های psmad2/3, smad2/3 در مسیر smad signaling  47۲-۸-۳ مرحله الکتروفوز. 48۲-۸-۴ مرحله ساندویچ. 48۲-۸-۵ مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌ها: 49۲-۸-۶ مرحله Stripping. 50۲-۸-۷ مرحله ظهور فیلم. 51۲-۹ آنالیزهای آماری.. 51فصل سوم نتایج.. 53۳-۱ بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست.. 54۳-۲ بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست.. 56۳-۳ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر مهاجرت سلول‌های فیبروبلاست    57۳-۴ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‌های مختلف لایزت پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر بیان ژن‌های Smad2 و Smad3 درسلول های فیبروبلاست تیمار شده. 62۳-۴-۱ کیفیت RNA استخراج‌شده. 62۳-۵ بررسی میزان بیان پروتئین‌های Smad2- P Smad3 Smad3 P Smad2 توسط وسترن بلات.. 68فصل چهارم بحث.. 724-1 بحث.. 734-2 نتیجه گیری.. 79۴-3 پیشنهاد‌ها 80 منابع. 81منابع انگلیسی.. 82فهرست جداولجدول 1- 1: لیست کامل از فاکتورهای رشد در پلاکت (22) 9جدول 1- 2: لیستی از محتویات α گرانول‌های پلاکتی (۲۲) 11جدول 2- 1: تجهیزات مورداستفاده. 28جدول 2- 2: مواد مصرفی جهت آزمایشات سلولی.. 29جدول 2- 3: مواد و وسایل موردنیاز برای بررسی بیان ژن. 29جدول 2- 4: مواد و وسایل موردنیاز برای تکنیک وسترن بلات.. 30جدول 2- 5: توالی پرایمر. 43فهرست اشکالشکل 1- 1: مرحله التهاب در فرایند ترمیم زخم (۱۴) 5شکل1- 2: مرحله شکل گیری بافت در فرایند ترمیم زخم (14) 6شکل 1- 3: اتصالات دو پلاکت در ایجاد لخته پلاکتی (22) 10شکل 1- 4: ارتباط مسیر سیگنالینگ smad2/3 با فرایند ترمیم زخم. 26شکل 2- 1: کشت سلول در پلیت ۶ خانه. 36شکل 2- 2: نحوه کشیدن خراش در تکنیک assay Scratch. 37شکل 2- 3: ۳ فاز تشکیل‌شده در استخراج RNA.. 38شکل 2- 4: نمای کلی از استخراج RNA.. 39شکل 2- 5: RNA استخراج‌شده بر روی ژل اگاروز. 41شکل 2- 6: ساختار شیمیایی سایبر گرین.. 44شکل 2- 7: مکانیسم عمل سایبر گرین.. 45شکل 2- 8: مرحله تهیه ساندویچ. 49شکل 2- 9: مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌ها 50شکل 3- 1: بررسی افزایش تکثیر در غلظت‌های متفاوت عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف در مقایسه با گروه‌های کنترل در ۲۴ ساعت    55شکل 3- 2: تأثیر غلظت‌های متفاوت UCB-PL بر تکثیر فیبروبلاست. در این شکل علامت* به معنی تفاوت معنی‌دار گروه ۱۰% در مقایسه با گروه‌های دیگر است. (p . 55شکل 3- 3: نمودار مربوط به تأثیر غلظت‌های متفاوت UCB-PL بر درصد بقا فیبروبلاست در این شکل علامت* به معنی تفاوت معنی‌دار گروه با غلظت ۱۰% در مقایسه با همه گروه‌های دیگر به‌جز گروه POS و ۱۵%-۸% است. 57شکل 3- 4: نمودار مربوط به تأثیر غلظت‌های متفاوت UCB-PL بر مهاجرت فیبروبلاست.a) p . 58شکل 3- 5: سنجش اثر UCB-PL ۸% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش... 58شکل 3- 6: سنجش اثر UCB-PL ۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش... 59شکل 3- 7: سنجش اثر UCB-PL/FBS بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش... 60شکل 3- 8: سنجش اثر FBS۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش... 61شکل 3- 9: سنجش اثر گروه کنترل منفی بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش... 62شکل 3- 10: کیفیت RNA استخراج‌شده در گروه‌های مختلف.. 63شکل 3- 11: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64شکل 3- 12: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64شکل 3- 13: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad۲. 65شکل 3- 14: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 65شکل 3- 15: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 66شکل 3- 16: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad3. 66شکل 3- 17: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad2 در سلول‌های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR   67شکل 3- 18: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad3 در سلول‌های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR   68شکل 3- 19: رنگ‌آمیزی ژل حاوی پروتئین‌ها 69شکل 3- 20: وسترن بلات برای پروتئین Smad2. 70شکل 3- 21: وسترن بلات برای پروتئین P Smad2. 70شکل 3- 22: وسترن بلات برای پروتئین Smad3. 70شکل 3- 23: وسترن بلات برای پروتئین p-Smad3. 71چکیدههدف:مواد مفید زیستی  مشتق از پلاکت ها نقش محوری در بهبود زخم ایفا می کنند. برای بررسی مکانیسم های سلولی ومولکولی بهبود زخم اثر عصاره پلاکت خون مشتق از خون بند ناف(UCB-PL)  بر فیبروبلاست ها، به عنوان سلول های قوی در بهبود زخم مورد مطالعه قرار گرفت. لذا به دلیل اینکه (UCB-PL)  دارای انواع فاکتورهای رشد است و قادر به شروع مسیر سیگنالینگ Smad می‌شود. در این مطالعه اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر و مهاجرت و درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست در شرایط آزمایشگاهی موردبررسی قرار گرفت.مواد و روش ها:عصاره پلاکتی مشتق از پلاسمای خون بند ناف را تهیه، و سپس فیبروبلاست ها توسط غلظت های مختلف (UCB-PL)   تحت تیمار قرار گرفتند. زنده ماندن سلولها، میزان گسترش و بهبود زخم با استفاده از  روش  manualمورد بررسی قرار گرفت. سپس مشخصات بیان ژن با استفاده از روش  real-time PCR انجام شد. در نهایت وسترن بلات به منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین های psmad2 / 3، smad2 / 3  از مسیر سیگنالینگ مورد استفاده قرار گرفت.یافته ها:نتایج نشان می دهد که افزایش  تکثیر سلولی در غلظت 10٪ (UCB-PL)   بدون اثر بر زنده ماندن سلولها می باشد.در همان غلظت(UCB-PL)  افزایش قابل توجهی از میزان بسته شدن زخم در 6-12 و 24 ساعت پس از تیمار دیده شد. همچنین تغییر نسبت بیان ژن در ژن Smad3 و Smad2 در غلظت10٪ از UCB- PL مقایسه با کنترل مثبت و منفی افزایش قابل توجهی داشت. روش وسترن بلات نشان داد که UCB- PL  اثر قابل توجهی بر سطوح پروتئین های Smad2، Smad3،Psmad2وPsamd3دارد.نتایج: UCB- PL باعث تحریک رشد و مهاجرت فیبروبلاست می شودکه موجب بهبود زخم از طریق فعال سازی مسیرهای سیگنالینگ های مختلف از جمله، SMAD 2/3 مسیر سیگنالینگ می گردد.واژه‌های کلیدی: ترمیم زخم، عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف، فیبروبلاست، مسیر سیگنالینگ smad

مقدمه

فرآورده عصاره پلاکتی[1] PL مشتق از خون‌بند ناف محصولی هست که از فرآورده پلاسمای غنی از پلاکتی PRP به دست می‌آید.. این ماده به علت غنی بودن از مواد مفید زیستی در ترمیم زخم‌ مورداستفاده قرار می‌گیرد. به دلیل اینکه PL دارای انواع فاکتورهای رشد است و قادر به شروع مسیر سیگنالینگ Smad می‌شود. در این مطالعه اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر و مهاجرت و درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست در شرایط آزمایشگاهی موردبررسی قرار گرفت. سلول‌های فیبروبلاست در محیط کشت DMEM حاوی غلظت‌های ۵%، ۸%، ۱۰%، ۱۵% و ۲۰% از عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف همراه با گروه کنترل مثبت که حاوی FBS 10% و کنترل منفی که خالی از هر ۲ (FBS و UCB-PL) بود، کشت شدند و همچنین از گروه (UCB-PL/FBS) که به نسبت مساوی از عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف و FBS استفاده شد. تعیین مقدار مناسب و مؤثر بر تکثیر و درصد بقاء سلولی توسط شمارش سلولی با تریپان‌بلو در زمان‌های متفاوت ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت بررسی شد. هم‌چنین برای تعیین مقدار مناسب برای مهاجرت سلولی از تکنیک Scarch assay استفاده شد. سپس اثر عصاره پلاکتی با غلظت‌های متفاوت بر بیان ژن‌های smad2-smad3 در سلول‌های فیبروبلاست توسط تست Real Time -PCR موردبررسی قرار گرفت. در مرحله آخر جهت بررسی اثر عصارهی پلاکتی بر مسیر سیگنالینگ Smad، مقدار بیان پروتئین‌های  Smad2-Smad3-Psmad2-Psmad3توسط تکنیک وسترن بلات ارزیابی شد.نتایج:در بررسی تکثیر و درصد بقاء و مهاجرت سلول‌های فیبروبلاست در اثر تیمار با عصاره پلاکتی بالاترین غلظت مؤثر مربوط به دز ۱۰% نشان داده شد و نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که افزایش غلظت عصاره پلاکتی، اثر افزایشی بر تکثیر و درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست ندارد. همچنین عصاره پلاکتی در دز ۱۰% سبب افزایش سرعت مهاجرت سلول‌های فیبروبلاست می‌شود. در نتایج حاصل از تکنیک Real time اثر عصاره پلاکتی در غلظت ۱۰% با افزایش بیان ژن‌های Smad2-Smad3 نسبت به گروه‌های کنترل منفی و مثبت با تفاوت معناداری نشان داده شد. در بررسی‌های صورت گرفته در سنجش اثر عصاره پلاکتی در غلظت‌های مختلف ۸%، ۱۰% و گروه UCB-PL/FBS و گروه کنترل مثبت و منفی بر بیان پروتئین‌های Smad2-Smad3-Psmad2-Psmad3 به‌واسطه تکنیک وسترن بلات نشان داد که تمامی گروه‌ها تفاوت معناداری نسبت به گروه کنترل منفی دارند. پروتئین‌های Psmad2-Psmad3 که پروتئین‌های فرم فعال‌شده Smad2-Smad3 هستند تنها در گروه کنترل منفی دیده نشدند بلکه در تمامی گروه‌هایی که داری عصاره پلاکتی بودند این پروتئین‌ها فعال شدند.نتیجه‌گیرییکی از مهم‌ترین سلول‌های دخیل در امر ترمیم زخم، فیبروبلاست­ها می‌باشند، که با تکثیر و مهاجرت سلولی و به راه انداختن مسیرهای سیگنالینگ درون‌سلولی مربوط به ترمیم زخم در پیشبرد فرایند ترمیم نقش کلیدی بر عهده‌دارند. در این مطالعه با نشان دادن اثر عصاره پلاکتی بر اعمال مهم و ضروری سلول‌های فیبروبلاست در فرایند ترمیم زخم می‌توان نتیجه گرفت که فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف می‌تواند نقش بسزایی در افزایش ترمیم زخم‌ها داشته باشد.تعداد صفحه : 103قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید