دانلود پایان نامه:بررسی مقاومت افزایش یافته به آنتی بیوتیک‌های گروه آمینوگلیکوزیدی (HLAR) در انتروکوکوس فکالیس با روش کشت و Multiplex-PCR

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

گرایش :میکروب شناسی

عنوان : بررسی مقاومت افزایش یافته به آنتی بیوتیک‌های گروه آمینوگلیکوزیدی (HLAR) در انتروکوکوس فکالیس با روش کشت و Multiplex-PCR

دانشگاه آزاد اسلامی واحد رشت

 

ﭘﺎﯾﺎن ﻧﺎﻣﻪ

ﺑﺮای درﯾﺎﻓﺖ درﺟﻪ ﮐﺎرﺷﻨﺎﺳﯽ ارﺷﺪ در رﺷﺘﻪ زیست شناسی

گرایش میکروب شناسی

 

عنوان

بررسی مقاومت افزایش یافته به آنتی بیوتیک‌های گروه آمینوگلیکوزیدی (HLAR) در انتروکوکوس فکالیس با روش کشت و Multiplex-PCR

استاد راهنما:

دکتر نور امیر مظفری

 

استادان مشاور:

دکتر لیلا اسدپور، مهندس هما فروهش تهرانی

زمستان 1392

 

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان ……..                     شماره صفحه

چکیده 10

فصل اول

کلیات.. 12

1- کلیات.. 12

1-1- مقدمه. 12

1-2- بیان مسئله. 13

1-3- انتروکوک ها. 14

1-3-1- طبقه بندی.. 14

1-3-2- خصوصیات بیولوژیک 17

1-3-3- تقسیم‌بندی ﻣﻮﻟﮑﻮﻟﯽ.. 17

1-3-4- ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ انتروکوکوس فکالیس… 18

1-3-5- فاکتورهای ویرولانس (بیماری زایی) 19

1-3-5-1- ﻣﻮاد ﺗﺠﻤﻌﯽ.. 20

1-3-5-2- سیتولیزین.. 21

1-3-5-3- ژلاتیناز. 21

1-3-5-4- فرومون ها 22

1-3-5-5- ﻟﯿﭙﻮﺗﯿﮑﻮﺋﯿﮏ اسید. 22

1-3-5-6-  ﻫﻤﻮﻟﯿﺰﯾﻦ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس فکالیس… 23

1-3-5-7-  آﻧﺘﯽ ژن آﻧﺪوﮐﺎردﯾﺘﯽ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ ((EfaA 23

1-3-5-7-1- ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ.. 24

1-3-5-8- ادهسین ﮐﻼژن  اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ (ACE) 24

1-4- اپیدمیولوژی انتروکوکوس فکالیس….. 27

1-5- اهمیت بالینی28

1-5-1- بیماریزایی: 29

1-5-1-1- باکتریمی: 29

1-5-1-2- ﻋﻔﻮﻧﺖ ﻣﺠﺎری ادراری: 32

1-5-1-3- اندوکاردیت.. 33

1-5-1-4- ﻋﻔﻮﻧﺖ ﻫﺎی داﺧﻞ ﺷﮑﻤﯽ، ﻟﮕﻨﯽ و ﺑﺎﻓﺘﻬﺎی ﻧﺮم. 33

1-5-1-5- ﺳﺎﯾﺮﻋﻔﻮﻧﺘﻬﺎی اﻧﺘﺮوکوکی.. 35

1-6- درمان.. 36

1-7- مقاومتهای آنتی بیوتیکی 37

1-7-1- ﻣﻘﺎوﻣﺖ آﻧﻬﺎ ﺑﻪ ﮔﻠﯿﮑﻮﭘﭙﺘﯿﺪﻫﺎ 39

1-7-2- ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ آﻧﺘﯽ ﺑﯿﻮﺗﯿﮑﻬﺎی ﺑﺘﺎﻻﮐﺘﺎم. 40

1-7-3- ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪآنتی بیوتیکهای ﺗﺘﺮاﺳﺎﯾﮑﻠﯿﻦ.. 41

1-7-4- مقاومت در برابر آنتی بیوتیک های ماکرولیدی.. 42

1-7-5-  ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ ﮐﻠﺮاﻣﻔﻨﯿﮑﻞ. 43

1-7-6- مقاومت به آمینوگلیکوزید ها 44

1-7-6-1- تاریخچه روند گسترش مقاومتهای آمینوگلیکوزیدی.. 45

1-7-6-2- انواع مقاومت به آمینوگلیکوزیدها 46

1-7-6-3- اهمیت مقاومت آمینوگلیکوزیدی.. 48

1-7-7- ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﭼﻨﺪ داروﺋﯽ.. 42

1-7-8- HLAR و افزایش مرگ و میز (Mortality) 42

1-8- PCR.. 44

1-8-1- Multiplex PCR. 44

1-8-2- طراحی و اجرای Multiplex PCR. 45

1-8-3- تیتراسیون اجزای واکنش: 46

1-8-4- شرایط ترموسایکلر: 47

19 تعریف واژه ها. 47

فصل دوم

( مبانی و تاریخچه) 51

2- مروری بر منابع. 52

فصل سوم

مواد و روش ها 62

3- مواد و روش ها 62

3-1- ﻧﮕﻬﺪاری ﺳﻮﯾﻪ ﻫﺎ: 62

32 ﻣﺤﯿﻂ ﻫﺎی ﮐﺸﺖ ﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده 62

3-3- لوازم و تجهیزات مورد استفاده. 62

3-4- محلولهای مورد استفاده و نحوه تهیه آنها. 64

3-5- آزمایش‌های بیوشیمیایی66

3-5-1- ﺗﺴﺖ ﮐﺎﺗﺎﻻز. 66

3-5-2- ﺗﻤﺎﯾﺰاﻧﺘﺮوکوک­ها از ﺳﺎﯾﺮ اﺳﺘﺮﭘﺘﻮکوک­ها 67

3-5-3- ﮐﺸﺖ ﺑﺮ روی ﺑﺎﯾﻞ اﺳﮑﻮﻟﯿﻦ آﮔﺎر. 67

3-5-4-  ﺗﺴﺖ ﺗﺨﻤﯿﺮ ﻗﻨﺪآراﺑﯿﻨﻮز. 67

3-6- رﺷﺪ در 10 و 45 درﺟﻪ ﺳﺎﻧﺘﯿﮕﺮاد 68

3-7- ﺗﻌﯿﯿﻦ اﻟﮕﻮی ﺣﺴﺎﺳﯿﺖ آﻧﺘﯽ ﺑﯿﻮﺗﯿﮑﯽ انتروکوکوس فکالیس….. 68

3-7-1- استاندارد نیم مک فارلند سولفات باریم: 70

3-7-2- آﻣﺎده ﮐﺮدن ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﯿﻮن ﺑﺎﮐﺘﺮی : 71

3-7-3- روش اﻧﺠﺎم آزﻣﺎﯾﺶ: 71

3-7-4- بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین.. 72

3-7-5- اﺳﺘﺨﺮاج DNA 73

3-7-5-1- استخراج از باکتری کشت داده شده : 73

3-7-6- اندازه‌گیری غلظت DNA ژنومیک تخلیص شده 73

3-7-7- انتخاب و تهیه پرایمر‌های مناسب.. 73

3-7-7-1- محلول کار پرایمر PCR. 73

3-7-8- روش اجرا Multiplex PCR. 73

3-7-8-1- PCR Amplification: 74

3-7-9- آشکارسازی محصولات PCR. 74

3-7-10- روش انجام الکتروفورز: 76

3-8- روش تجزیه و تحلیل داده ها: 77

3-9- ملاحظات اخلاقی: 78

3-10- مشکلات ومحدویت ها: 78

3-11- متغیر ها: 79

فصل چهارم

4- نتایج مطالعه. 81

4-1- نتایج مربوط به تست بیوشیمیایی81

4-2- نتایج مربوط تفکیک جنسیت تمام نمونه ها. 82

4-3- نتایج مربوط به تفکیک جنسیت  تمام نمونه ها. 82

4-4- نتایج مربوط به تفکیک گروه های سنی83

4-5- نتایج مربوط به حساسیت آنتی بیوتیکی83

4-5-1- نتایج بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین.. 83

4-6- نتایج مربوط به واکنش زنجیره ای پلی مراز. 84

4-6-1- استخراج ژنوم. 87

4-6-2- واکنش  PCR. 90

4-6-3- نتایج مربوط به الکتروفورز محصولات PCR : 91

فصل پنجم

بحث و پیشنهادات.. 102

منابع: 111

منابع: 111

فهرست اشکال

شکل ‏1‑1: ساختار فضایی استرپتومایسین.. 36

شکل ‏1‑2: ساختار فضایی کانامایسین.. 37

شکل ‏1‑3: ساختار فضایی آمیکاسین.. 37

شکل ‏1‑4: ساختار فضایی جنتامایسین.. 37

شکل ‏4‑1: الف) شکل سمت چپ کلونی های رشد کرده انتروکوک بر روی بلادآگار را نشان می دهد. ب) شکل سمت راست محیط کشت بایل اسکولین آگار در شبشه های دربسته 5 سی سی می‌باشد،  تیره شدن محیط که نشان دهنده کمپلس آهن و اسکولین می‌باشد، رشد باکتری را تایید می کند. 77

شکل 43‑2: نتایج تست آرابینوز برای تفکیک سویههای مورد بررسی از همدیگر. 78

شکل 4‑3 : نتایج حاصل از تفکیک نمونههای جمع آوری شده بر اساس جنسیت مورد بررسی. 78

شکل ‏4‑4:  نتایج حاصل از تفکیک نمونههای انتروکوکوس فکالیس در افراد مورد بررسی.. 79

شکل ‏4‑5: نتایج حاصل از تفکیک نمونههای انتروکوکوس فاسیوم در افراد مورد بررسی. 79

شکل ‏4‑6 نتایج مربوط به گروه های سنی که در پژوهش حاضر مورد ارزیابی قرار گرفتند. 80

شکل ‏4‑7: نتایج مربوط به گروه های سنی نمونه های انتروکوکس فکالیس…. 81

شکل ‏4‑8: نتایج حاصل از وضعیت گروههای سنی در ارتباط با نمونههای انتروکوکوس فاسیوم. 81

شکل ‏4‑9 : تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن.  از انتروکوکوس فکالیس ATCC29212 نیز به عنوان کنترل منفی استفاده گردید. 82

شکل ‏4‑10: از مجموع تمام نمونه های انتروکوکوس فکالیس بدست آمده، تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن صورت پذیرفت. از انتروکوکوس فکالیس ATCC29212 نیز به عنوان کنترل منفی  استفاده گردید. 82

شکل ‏4‑11: مقاومت آنتی بیوتیکی انواع نمونه ها به جنتامایسین.. 84

شکل 4‑12: مقاومت آنتی بیوتیکی انواع نمونه ها به استرپتومایسین.. 85

فهرست جداول

جدول ‏4‑1: پرایمرهای استفاده شده در این مطالعه برای پیدا کردن سویه‌های مقاوم به آمینوگلیکوزید. 69

جدول ‏4‑1: نتایج مربوط به جنسیت نمونه های مثبت بدست آمده. مشخص شده است. 80

جدول ‏4‑2: نتایج بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین  برای انتروکوکوس فکالیس     83

جدول ‏4‑3: نتایج بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین  برای انتروکوکوس فاسیوم  83

چکیده

زمینه وهدف: انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم با توانمندی بالا در ایجاد بیماری­های عفونی مانند اندوکاردیت، عفونت ادراری و مننژیت هستند. توانمندی بالای آنها برای کسب ژن­های مقاومت به آنتی بیوتیک، درمان آنها را با مشکلات جدید مواجه کرده است. هدف از این مطالعه بررسی مقاومت افزایشی انتروکوکوس فکالیس و فاسیوم به آنتی بیوتیک های آمینوگلیکوزیدی بوده است.

مواد و روش ها: 100 نمونه انتروکوک از آزمایشگاه بالینی نور تهران، پس از جمع آوری با استفاده از تست های بیوشیمیایی معمول، شناسایی شدند. برای سویه‌های جدا شده تست تعیین حساسیت گونه­ها به آنتی بیوتیک­های آمینوگلیکوزیدی با غلظت­های افزایش یافته جنتامایسین 120 میکروگرم و استرپتومایسین 300 میکروگرم و همین طور دیگر آنتی بیوتیک­های آمینوگلیکوزیدی با استفاده از روش دیسک دیفیوژن انجام شد. در نهایت به منظور شناسایی مولکولی مقاومت، حضور 6 ژن عامل ایجاد مقاومت با استفاده از روش Multiplex PCR بررسی شدند.

نتایج:  از 100 ایزوله، 84% انتروکوکوس فکالیس و 16% انتروکوکوس فاسیوم بودند. با روش دیسک دیفیوژن مشخص گردید 56% از نمونه­ها به هر دو آنتی­بیوتیک جنتامایسین و استرپتومایسین با غلظت­های افزایش یافته مقاوم بودند. همچنین بیشترین مقاومت به تتراسایکلین مشاهده شد و ژن مقاومت در ایزوله­های ادرار بیش از بقیه نمونه­ها وجود داشت. در این مطالعه 18 سویه­ به ونکومایسین نیز مقاوم بودند. نتایج PCR نشان داد حضور ژن­های aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia ، ant(4’)-Ia و aph(3’)-IIIa به ترتیب 60% ، 30% و 50% بودند. 9 ایزوله هر سه ژن را داشتند. همچنین ژن­های aph(2’’)-Ib ، aph(2’’)-Ic و aph(2’’)-Id شناسایی نشدند.

بحث: به دلیل وجود مقاومت دارویی در انتروکوک پیشنهاد می­شود از روش­های مولکولی مانند PCR برای تشخیص سریع و نهایی مقاومت در کنار روش­های دیسک گزاری استفاده شود. تشخیص درست، سریع و قطعی، تنها راه جلوگیری از افزایش مقاومت به آنتی بیوتیک­ها و گسترس پدیده HLAR  است.

کلمات کلیدی: انتروکوکوس فکالیس، انتروکوکس فاسیوم، مقاومت آنتی بیوتیکی، آمینوگلیکوزید، MultiplexPCR

فصل اول

کلیات

1-1-مقدمه

انتروکوک­ها کوکسی­های گرم مثبتی هستند که اگر چه به طور معمول فلور نرمال دستگاه گوارش انسان و حیوانات محسوب می­شوند، ولی امروزه آنها به عنوان عامل مهم عفونت­های بیمارستانی مطرح هستند (1). این باکتری­ها به علت کسب مقاومت­های چندگانه به انواع آنتی بیوتیک­ها، به عنوان یکی از مشکلات درمانی محسوب  می‌شوند. از جمله مقاومت­هایی که در انتروکوک­ها ایجاد شده است می­توان به مقاومت نسبت به دوزهای بالای آمینوگلیکوزیدها، بتالاکتام­ها و گلیگوپپتیدها اشاره کرد و از آنجائی که معمولاً ونکومایسین به عنوان آخرین راه حل درمانی برای سویه‌های مقاوم به چند دارو استفاده می­شود (2)، بنابراین مقاومت به ونکومایسین در بین سویه‌های انتروکوکی دارای اهمیت به سزایی است، مقاومت به آمینو گلیکوزیدها نیز به دلیل شکست درمانی در سینرژی یک داروی موثر بر دیواره باکتری (مثل پنی سیلین) و آمینو گلیکوزیدها، مشکل دیگری را در درمان آنها ایجاد کرده است (3)، خصوصاً اینکه، این مقاومت­ها می­توانند توسط عناصر ژنتیکی مختلفی مثل ترانسپوزون­ها و پلاسمیدها بین گونه­های انتروکوکی و حتی بین جنس­های باکتریایی منتقل شوند و در نتیجه طیف وسیعی از باکتری­ها را درگیر کنند (4).

حضور ژن­های مقاومت برروی کروموزم باکتریایی و یا پلاسمیدی می­توانند مقاومت به چندین آنتی­بیوتیک خانواده آمینو­گلیکوزیدی را ایجاد کند. بنابراین تعیین فراوانی ژن­های مقاومت به آمینو گلیکوزیدها می­تواند در انتخاب یک رژیم درمانی مناسب، موثر باشد (5).

انتروکوک­ها که سالیان  متوالی، تنها به عنوان فلور غیربیماریزای دستگاه گوارش انسان و حیوانات محسوب می­شدند، در طول دو دهه گذشته، به سبب نقش موثری که در ایجاد عفونت‌های بیمارستانی داشته و استعداد ویژه­ای که در کسب مقاومت­های چندگانه نسبت به انواع آنتی بیوتیک­های مرسوم نشان داده اند، به شدت مورد توجه قرار گرفته­اند (6, 7).

از انواع مقاومت­هایی که نسبت به آنتی بیوتیک­های مختلف  در انتروکوک­ها مشاهده می­گردد می­توان به مقاومت نسبت به دوزهای بالای آنتی بیوتیک­هایی از خانواده­های بتالاکتام­ها ( (8)، گلیکوپپتیدها (9) و آمینوگلیکوزیدها (10)  اشاره نمود.

درباره اهمیت مقاومت به دوزهای بالای آمینوگلیکوزیدها  کافی است بدانیم درمان عفونت­های سیستمیک چون اندوکاردیت­ها (11)، باکتریمی (12)و مننژیت (13) تنها در حضور رژیم­های درمانی که حاصل ترکیب آنتی­بیوتیکی با این گروه دارویی است، امکان پذیر می‌باشد.  آمینو گلیکوزیدها به جهت مشاهده مقادیر روزافزون مقاومت به دوزهای بالای آنها و نقش موثری که عناصر ژنتیکی متحرک خارج کروموزمی همچون پلاسمیدها در گسترش این نوع از مقاومتها بر عهده دارند، از جایگاه ویژه­ای برخوردارند (14). امروزه، دستیابی و بکارگیری بهترین، مطمئن ترین و سریعترین روش به منظور تشخیص حضور این نوع مقاومت، تعیین مقادیر MIC[1] آنها و نیز یافتن علل انتشار و پراکندگی آنها و در آخر قضاوت پیرامون کارا بودن و یا عدم کارایی این خانواده آنتی بیوتیکی در رژیم­های دارویی، از مهمترین وظایف آزمایشگاه­های مرجع، تشخیص طبی و بیمارستان­ها می‌باشد.

تعداد صفحه : 136

قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09199970560        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

شماره کارت :  6037997263131360 بانک ملی به نام محمد علی رودسرابی

11

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید