دانلود پایان نامه:بهینه سازی فرآیند تولید پروتئینهای نوترکیب در سیستم بیان موقت TGE (Transient Gene Expression) از دیدگاه Scale –Up در بیوپروسه

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

عنوان : بهینه سازی فرآیند تولید پروتئینهای نوترکیب درسیستم بیان موقت TGE (Transient Gene Expression) از دیدگاه Scale –Up در بیوپروسه

واحد علوم و تحقیقات

پایان نامه کارشناسی ارشد زیست شناسی (M.Sc)

 

موضوع

بهینه سازی فرآیند تولید پروتئینهای نوترکیب در

سیستم بیان موقت TGE (Transient Gene Expression) از دیدگاه Scale –Up در بیوپروسه

 

استاد راهنما

دکتر فاطمه دوامی

 

استاد مشاور

دکتر یگانه طالب خان گروسی

 

سال تحصیلی 92-1391

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان.

چکیده 9

مقدمه. 10

1-1)اهمیت پروتئینهای نوترکیب -جایگاه جهانی و درمانی.. 10

1-2)بیماری های قلبی عروقی.. 12

1-3)پاتوفیزیولوژی ترومبوآمبولی.. 12

1-3-1)سکته مغزی.. 12

1-3-2)ترومبوآمبولی عروق عمقی اندام ها 12

1-4) مسیر انعقاد. 13

1-5) فیبرینولیز. 14

1-6) درمان. 16

1-7) داروهای ترومبولیتیک… 17

1-8)جنبه های اقتصادی.. 18

1-9) تاریخچه داروهای ترومبولیتیک… 18

1-10)روش های مقابله با ترومبوآمبولی.. 19

1-11)تجزیه لخته های فیبرینی.. 20

1-12)مهار کننده های t-PA.. 20

1-12-1) 2   α آنتی پلاسمین.. 21

1-12-2) 2 α ماکروگلوبین.. 21

1-12-3) TAF-I)) Thrombin Activable Fibrinogen Inhibitor. 21

1-13)سنتز t-PA.. 22

1-14)میل الحاقی به فیبرین.. 22

1-15)غلظت-فعالیت و نیمه عمر. 22

1-16)ساختار دومن ها 23

1-17)تاریخچه درمان تجزیه لخته. 24

1-18)داروهای تجزیه کننده فیبرین.. 24

1-19)طبقه‌بندی داروهای ترومبولیتیک… 24

1-20)انواع فعال کننده های  پلاسمینوژن. 25

1-20-1) Streptokinase. 27

1-20-2) Urokinase. 27

1-20-3) Staphylokinase. 28

1-20-4) Alteplase. 28

1-20-5) Reteplase. 29

1-20-6) Tenecteplase. 30

1-20-7) Lanoteplase. 30

1-21) Truncated t-PA.. 30

1-20-8) میزبان های رایج در تولید پروتئین های نوترکیب… 32

1-21)انتخاب رده سلولی مناسب… 33

1-22)رده های  سلولی رایج  در بیان پروتئین های نوترکیب… 34

1-23)مزایای CHO.. 34

1-24)روش های بیان ژن. 34

1-24-1)سیستم بیان پایدار ژن Transient Gene Expression)) 34

1-24-2)سیستم بیان موقت ژن Transient gene expression)) 34

1-25)روش های انتقال ژن به سلول های پستانداران. 36

1-25-1)روشهای انتقال ژن غیر ویروسی.. 36

1-26)فاکتور های دخیل در کشت سلول های نوترکیب… 37

1-27)انواع سلول ها از نظر نحوه کشت… 37

1-27-1)سلول های غیر وابسته به بستر. 37

1-27-2)سلول‌های وابسته به بستر. 38

1-28) کشت معلق.. 38

1-29)انتخاب محیط کشت مناسب و شرایط محیط کشت… 39

1-30)بهینه سازی شرایط کشت سلول. 39

1-31)متابولیسم سلولی و تولید متابولیت های سلولی.. 39

1-31-1)نقش گلوکز در محیط کشت… 40

1-32)عناصر تشکیل دهنده محیط کشت… 41

1-32-1)عناصر ماکرو. 42

1-32-2)عناصر میکرو. 42

1-32-3)نقش عناصر میکرو در محیط کشت… 42

1-32-4)ویتامین ها  43

1-32-5) Pluronic acid. 43

1-33)نقش گلوتامین در محیط کشت… 44

مواد و روش ها 46

2-1)دستگاه های مورد نیاز. 47

2-2) میکروارگانیسم ها و سلول های مورد استفاده 47

2-3)لیست کامل مواد استفاده شده 48

2-4) لیست کامل وسایل مورد استفاده 50

2-5) شرایط لازم جهت انجام کشت سلول rCHO DG44. 50

2-5-1)محیط های کشت جهت فرایند بهینه سازی.. 51

2-5-1-1)تهیه محیط کشت BRC.. 51

2-5-1-2)ذخیره سازی سلول ها و محیط های کشت… 51

2-6)آماده سازی سلول هایrCHO DG44. 52

2-7) دفریز نمودن سلولهایrCHO DG44. 52

2-8) انکوباسیون سلول هایrCHO DG44. 53

2-8-1)انکوباتور دی اکسید کربن.. 53

2-8-2)دمای انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44. 53

2-8-3) میزان co2 انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44. 54

2-8-4) رطوبت انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44. 54

2-9) استریلیزاسیون انکوباتور. 54

2-10)  آنتی بیوتیک ها و آنتی مایکوتیک ها 55

2-10-1) میزان مصرف آنتی بیوتیک… 55

2-11) کشت سلول های rCHO DG44. 56

2-12)ارزیابی وضعیت محیط کشت از نظر pH.. 56

2-13) شمارش سلول های rCHO DG44. 57

2-13-1)اصول شمارش سلول. 57

2-13-2)تعیین درصد سلول های زنده Viability)) 59

2-13-3) انجماد سلولها و ذخیره سازی آنها  Cell Freezing)) 59

2-14)ترانسفکشن سلول rCHO DG44. 60

2-14-1)پلاسمید حاوی ژن. 60

2-14-2)تهیه DNA‌ 60

2-14-3)کشت سلول. 61

2-15)بهینه سازی فرایند TGE. 61

2-15-1)ترانسفکشن به روش PEI 61

2-15-2)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE. 61

2-15-3)بررسی میزان بهینه DNA جهت انجام TGE. 62

2-15-4)اندازه گیری میزان درصد ترانسفکشن.. 62

2-15-4-1)اندازه گیری GFP به روش فلوسایتومتری.. 62

2-16)افزودن  غلظت های متفاوت پپتون های گیاهی به محیط های کشت… 62

2-16-1) تعیین پروفایل رشد. 70

2-16-2)تعیین پروفایل بیان به روش  Elisa. 70

2-16-2) بررسی تغییرات رفتار متابولیک سلول ها 72

نتایج.. 76

3-1)ترانسفکشن سلول های rCHO DG44 به روش TGE. 76

3-1-1)بررسی میزان بهینه PEI جهت انجام TGE. 76

3-1-2)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE. 83

3-1-3)بررسی میزان بهینه  DNAجهت انجام TGE. 96

3-2)تعیین الگوی رشد سلول های CH0 DG44 در محیط های کشت  ProCHO 5,CD DG44و BRC.. 109

3-3)غلظت پپتون ها وابسته به نوع محیط کشت… 110

3-4)بررسی تغییرات متابولیکی در سلول های CHO DG44 تولید کننده t-PA.. 115

3-4-1)بررسی تغییرات متابولیکی در محیط ProCHO 5. 115

3-4-2)تغییرات متابولیکی در محیط CD DG44. 117

3-4-3)  بررسی تغییرات متابولیکی در محیط BRC CD.. 118

3-5)بررسی تاثیر پپتون ها بر میزان بیان پروتئین نوترکیب… 119

3-6)بررسی تاثیر  استراتژی تغذیه با پپتون های گیاهی در بهینه سازی TGE. 121

بحث و نتیجه گیری نهایی.. 129

منابع. 133

اختصارات… 136

Optimization of recombinant protein production in TGE system… 137

Abstract 137

 

چکیده

بیماری عروق کرونر قلب یکی از شایع ترین بیماری ها در سطح جهان به خصوص کشور های صنعتی می باشد.

فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی (t-PA( Tissue Plasminogen Activator، یک پپتید طبیعی است که با اتصال به فیبرین موجود در لخته و تبدیل پلاسمینوژن به پلاسمین باعث شکسته شدن فیبرین، فیبرینوژن و سایر پروتئین‌های انعقادی شده و  با رفع انسداد باعث به حداقل رساندن آسیب بافتی و در نهایت نجات بیمار می‌شود. پروتئین مورد بررسی در این مطالعه فرم کوتاه شده موتانت از داروی t-PA باخواص فارماکولوژیک بهینه می باشد که در میزبان بیانی CHO(Chinese Hamster Ovary) با هدف تغییرات پس ترجمه ای مناسب و مشابه فرم طبیعی بیان می شود.

بیان موقت پروتئین(Transient Gene Expression) TGE روش رایجی برای بیان پروتئین های نو ترکیب در بازه زمانی کوتاه و در مقیاس مناسب جهت انجام تست های پیش بالینی Preclinical)) می باشد.در این مطالعه از این روش و بهینه سازی آن برای تولید پروتئین نوترکیب t-PA استفاده شد و مقادیر بهینه شده برای میزان cell  DNA106/µg2 وبرای عامل انتقال ژن Transfection reagent)) cell  106/µg5/1 و میزان سلول مورد استفاده 105×5 سلول معین گردید.همچنین با دیدگاه Scale-up در بیوپروسه و اثر استراتژی های تغذیه ای با عوامل پپتونی مختلف بر میزان بیان و رشد پروتئین و تغییر رفتار متابولیک آن بررسی گردید.به منظور بهینه سازی بیان فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی (t-PA)در سلول CHO  در این فرایند از 6 پپتون با منشا گیاهی(Soy,Casein) مختلف استفاده گردید .آنالیز نتایج نشان داد که چگونگی تاثیر پپتون ها بر روی بیان ژن مورد نظر در سلول CHO در تعدادی از پپتون ها از الگوی خاصی تبعیت می کند.در برخی موارد اثر مثبت و در موارد خاصی تاثیر منفی داشته است , که احتمالا این تاثیرات ناشی از ماهیت ترکیب آمینو اسیدی پپتون های به کار رفته می باشد. همچنین استفاده از این ترکیبات پپتونی در محیط کشت سلول ترانسفکت شده علاوه بر افزایش بیان پروتئین  می تواند سبب کاهش تولید متابولیت های نامطلوب نیز شود.

واژه های کلیدی: سلول CHO , t-PA , فیبرینولیز  ,فیبرینوژن

مقدمه

1-1)اهمیت پروئینهای نوترکیب – جایگاه جهانی و درمانی

پروتئین ها ماکرومولکولهایی هستند که در هرجایی از سلولها جای می گیرند.آنها در رشد سلولی، متابولیسم، سازماندهی، انتقال و جهش نقش دارند. در ارگانیسم های چندسلولی، پروتئین ها سیستم ایمنی، سیگنال بندی عصب، رشد و تقسیم کل ارگانیسم را کنترل می کنند.جهش یا رونویسی غیرعادی پروتئین ها می تواند منشاء بیماریهای بسیاری شود. با توجه به اینکه ژنوم انسان حاوی بیش از 30.000 ژن است و اینکه تعداد پروتئین هایی که تولید می شوند حتی بیشتر از این مقدار هستند،فرصت هایی برای شرکت های داروسازی به دست آمده تا داروهای جدیدی را توسعه دهند که بسیار فراوان هستند. بنابراین در طول دهه های گذشته،پروتئین ها به اهدافی برای توسعه درمانهای جدید تبدیل شدند. وقتی که پروتئین ها اولین بار به عنوان موارد درمانی مورد استفاده قرار گرفتند، از منابع انسانی و حیوانی خالص سازی شدند. نمونه هایی از این قبیل شامل هورمون رشد انسان از جسد انسان، انسولین از گاو یا خوک و هورمون تحریک کننده غدد ترشحی انسان از اوره می شدند. به هر حال استفاده از این منابع با نگرانی هایی هم همراه بود.خوشبختانه امروزه محصولات منابع حیوانی کمتر به کار می روند. در واقع از اواخر دهه 1970، رشد در بیوتکنولوژی امکان تولید پروتئین از “DNA دارای صفات ارثی” با استفاده از سیستم های میزبان پروکاریوتی یا یوکاریوتی را فراهم کرده است.این پروتئین ها ، دارای صفات ارثی هستند و از پروتئین های داخلی قابل تمایز هستند، آنها بواسطه رونویسی ژنهایی که دارای صفات ارثی جدید هستند، تولید می شوند. اولین پروتئین  نوترکیب، که برای انسان به کار رفت انسولین بود که در E.coli توسط Eli Lili در سال 1984 تولید شد. اولین پروتئین نوترکیب تولید شده در میزبان یوکاریوتی ، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی t-PA از سلولهای تخمدان هامستر چینی CHO2 بود که در سال 1986 تولید شد. در سال 2007، بیش از 170 محصول بیودارویی وجود داشت که توسط انجمن دارو و غذا FDA در ایالات متحده تائید شد، اما انتظار می رفت که در سالهای آتی این مقدار افزایش یابد، در سال 2006، حدود 5.000 محصول پروتئینی در آزمایشات اکتشافی و بالینی و پیش بالینی گزارش شد.در میان سیستم های رونویسی کننده میزبان، آنچه که بسیار کاربرد داشت سلولهای کشت شده پستانداران و E.coli بود. حدود نیمی از محصولات پروتئینی درمانی در بازار از سلولهای پستانداران تولید می شد. حتی اگر بافت سلول پستانداران پیچیده و پرهزینه تری نسبت به کشت میکروبی بود باز این سلولها ارجحیت داشتند زیرا سلولهای پستانداران قادر به اصلاح پروتئین ها بعد از PTM (Post Translational Modification) ، و بخصوص گلیکوزیلاسیون بودند.میزبانهای دیگر قادر گلیکوزیلدار کردن پروتئین ها بودند مثل مخمر و سلولهای گیاهان و حشرات کشت شده. این فرایند در این میزبان ها نسبت به آنچه که در سلولهای پستانداران دیده شد، متفاوت بود.اما تلاشها همچنان ادامه داشت تا گلیکوزیلاسیون در این میزبانهای غیر پستاندار هم به شکل پستانداران هدایت شود. در سال 2007، FDA اولین بیودارویی که در سلولهای حشرات برای کاربریهای انسانی تولید شده بود، تائید کرد.میزبانهای جایگزین شامل حیوانات و گیاهان ترنس ژنیک می شدند اما اینها هنوز در مرحله توسعه قرار داشتند.

در سال 1973 Staley Cohenو Herbert Boyer به عنوان  پیشگام در استفاده از تکنولوژی DNA نوترکیب برای کلونینگ و بیان ژن خارجی در موجودات شناخته شدند.

تولید اولین پروتئین نوترکیب انسانی چند سال بعد از، زمانی که  شرکت زیست فناوری  Genetchبیان ژن سوماتوستاتین انسانی را در E. coli را اعلام کرد  گزارش شد. میزان فعالیت هورمون به دست امده  معادل استخراج سوماتوستاتین از مغز 500.000 راس گوسفند بود. به دنبال این موفقیت در سال 1982 Genetch با humulin ، که انسولین نوترکیب به دست امده از E.coli  بود را به عنوان اولین نوترکیب داروی زیست فناوری پذیرفته شده  توسط غذا و داروی آمریکا (FDA) را  به بازار عرضه کرد.

آنها DNA پلاسمید RSF1010 استرپتومایسین مقاومت از سالمونلا تیفی موریوم را به  پلاسمید به pSC101 اشرشیاکلی را کلون نمودند و وجود مقاومت  به استرپتومایسین در سلولهای ترانسفورم شده را مشاهده کردند.

ساخت پروتئین نوترکیب یک  مرحله چالش برانگیز درفرآیند کشف و تولید دارو می باشد.

نهادهای توسعه یافته از صنعت بیوتکنولوژی  دارویی عمدتا بر مبنای تولید  آنتی بادی مونوکلونال (mAbs) و قطعات آن  هستند.

امروزه نیاز به پروتئینهای نوترکیب در تحقیقات پایه و کاربردهای بالینی رشد روز افزونی از خود نشان می دهد.

طی سال های اخیر تکنیکهای بیوتکنولوژی با ایجاد تحول درزمینه بهداشت ومواد غذایی رویکرد جهانی به این علم را افزایش داده است و محصولات نوترکیب که با روش های مهندسی ژنتیک و دستورزی ژنی و DNA نوترکیب در موجودات مختلف تولید شده تحول عظیمی در نوع و تنوع فراورده های دارویی به وجود آورده است.

داروها و واکسن هایی که از طریق بیوتکنولوژی ساخته شده اند سالانه به میلیون ها انسان که از بیماری های قلبی, سرطان, دیابت, پارکینسون, آلزایمر و … رنج می برند کمک  می کند. و امروزه فراورده های نوترکیب دارویی با وزن مولکولی بالا جایگزین مولکول کوچک شیمیایی شده اند. امروزه تولید پروتئین های نوترکیب به یک صنعت بزرگ جهانی با حجم سالانه بیش از 50 میلیارد دلار تبدیل شده است.  و میزان رشد سالیانه آن 20% تخمین زده می شود.

در بخش صنعتی سلول CHO در تولید فاکتورهای انعقادی 7و 8و9 , کلسی تونین,  DNAse بیماری سیستیک فیبروزیس, اریتروپویتین ,FSH,LH,گنادوتروپین ,داربپویتین, فاکتور Stem cell , t-PA , اینترفرون بتا و فاکتور فعال کننده رشد پلاکتی(PDGF) کاربرد دارد.

تعداد صفحه : 137

قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09199970560        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

شماره کارت :  6037997263131360 بانک ملی به نام محمد علی رودسرابی

11

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید