دانلود پایان نامه:تاثیر کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه­ای بر بیان ژن­های اختصاصی اندودرم اولیه رویان موش

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست­ شناسی

گرایش :سلولی- مولکولی

عنوان : تاثیر کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه­ای بر بیان ژن­های اختصاصی اندودرم اولیه رویان موش

وزارت علوم، تحقیقات و فناوری

پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست­ فناوری

پژوهشکده زیست­ فناوری پزشکی

 

پایان نامه کارشناسی‌ ارشد

در رشته زیست­ شناسی سلولی- مولکولی

 

عنوان:

تاثیر کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه­ای بر بیان ژن­های

اختصاصی اندودرم اولیه رویان موش

اساتید راهنما:

دکتر مجتبی دشتی­زاد

دکتر قاسم آهنگری

 

استاد مشاور:

دکتر مهدی شمس­آرا

 

اسفند ماه سال 1393

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

1     مقدمه و مروری بر مطالعات انجام شده2

1-1     تکوین پیش از لانه­گزینی در موش3

1-1-1    لقاح.. 3

1-1-2     تکوین اولیه. 5

1-1-3     مکانیسم­های مولکولی دخیل در لایه­زایی رویان. 9

1-1-3-1     جدایی دو رده­ی سلولی تروفواکتودرم و توده سلولی داخلی.. 10

1-1-3-2     جدایی دو رده­ی سلولی اپی­بلاست و اندودرم اولیه. 11

1-2     تکنیک­های کمک باروری13

1-2-1     لقاح آزمایشگاهی.. 13

1-2-1-1      کیفیت سلول تخم. 14

1-2-2     کشت آزمایشگاهی رویان. 15

1-2-3     انجماد. 16

1-2-3-1     اصول انجماد. 17

1-2-3-2     مواد سرما محافظ.. 18

1-2-3-3     روش­های انجماد. 19

1-2-3-3-1     انجماد آهسته. 20

1-2-3-3-2     انجماد شیشه­ای.. 21

1-2-4     سوراخ کردن مصنوعی.. 22

2     مواد و روش­ها…………………..25

2-1     حیوان.25

2-2     تولید رویان آزمایشگاهی26

2-2-1     استحصال اسپرم. 26

2-2-1-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 26

2-2-1-2     جابجایی مهره­ی گردنی.. 27

2-2-1-3     تشریح موش نر و جداسازی اپیدیدیم. 28

2-2-1-4     جمع­آوری و ظرفیت­پذیری اسپرم. 29

2-2-2     استحصال تخمک… 31

2-2-2-1     تحریک تخمک­گذاری.. 31

2-2-2-1-1      تزریق داخل صفاقی.. 31

2-2-2-2     آماده­سازی محیط و قطره­ها 32

2-2-2-3     جابجایی مهره­ی گردنی.. 32

2-2-2-4     تشریح موش ماده و جداسازی لوله­ی تخم­بر. 32

2-2-2-5     جداسازی توده­ی تخمک-کومولوس… 33

2-2-3     لقاح آزمایشگاهی.. 34

2-2-3-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 34

2-2-3-2     لقاح.. 35

2-2-4     کشت آزمایشگاهی.. 35

2-2-4-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 35

2-2-4-2     کشت رویان. 36

2-3     تولید رویان درون­تنی37

2-3-1     تحریک تخمک­گذاری و جفت اندازی موش­ها 37

2-3-2     آماده­سازی محیط و قطره­ها 37

2-3-3     جابجایی مهره­ی گردنی.. 37

2-3-4     تشریح موش ماده و جداسازی لوله­های رحمی.. 37

2-3-5     استحصال بلاستوسیست… 38

2-4     سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست39

2-4-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 39

2-4-2     آماده­سازی و تنظیم دستگاه ریز­دستکاری.. 40

2-4-3     روش کار. 40

2-5     انجماد رویان41

2-5-1     انجماد شیشه­ای.. 41

2-5-1-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 41

2-5-1-2   روش کار. 42

2-5-2        یخ­گشایی.. 43

2-5-2-1     آماده­سازی محیط و قطرات… 43

2-5-2-2   روش کار. 44

2-6     بررسی بیان ژن.45

2-6-1     استخراج RNA از بلاستوسیست… 45

2-6-2     ساخت cDNA.. 46

2-6-3      طراحی پرایمر. 47

2-6-4     رقیق­سازی پرایمرها 47

2-6-5     واکنش زنجیرهای پلیمراز. 48

2-6-6     ژل الکتروفورز محصولات PCR.. 49

2-6-7     واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 49

2-7     طراحی آزمایش52

2-7-1     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های درون­تنی موش، قبل از انجماد شیشه­ای52

2-7-2     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های برون­تنی موش، قبل از انجماد شیشه­ای..52

2-7-3     آنالیز آماری.. 52

3     نتایج.54

3-1     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های درون­تنی موش قبل از انجماد  شیشه­ای……………54

3-1-1     نرخ زنده­مانی و خروج از زونا 54

3-1-2     بیان نسبی ژن­های Gata6 و Grb2. 56

3-1-2-1     واکنش زنجیرهای پلیمراز. 56

3-1-2-2     واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 57

3-2      کاهش مایع بلاستوسل رویان­های برون­تنی موش قبل از انجماد  شیشه­ای.62

3-2-1     نرخ زنده­مانی و خروج از زونا 62

3-2-2     بیان نسبی ژن­های Gata6 و Grb2. 64

4     بحث و نتیجه­گیری67

5     فهرست منابع..76

6     پیوست­ها83

فهرست جداول

جدول ‏1‑1: ترکیبات محیط HTF. 14

جدول ‏1‑2: ترکیبات محیط KSOM.. 16

جدول ‏2‑1: محلول­های مورد نیاز برای انجماد شیشه­ای بلاستوسیست موش.. 42

جدول ‏2‑2: محلول­های مورد نیاز برای یخ­گشایی بلاستوسیست موش.. 44

جدول ‏2‑3: مواد مورد استفاده جهت ساخت cDNA. 46

جدول ‏2‑4: چرخه­های حرارتی ساخت cDNA. 46

جدول ‏2‑5: مشخصات پرایمرهای طراحی شده 47

جدول ‏2‑6: مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز 48

جدول ‏2‑7: چرخه­های حرارتی مراحلPCR 48

جدول ‏2‑8: مواد مورد نیاز جهت انجام Real Time PCR. 50

جدول ‏2‑9: چرخه­های حرارتی Real Time PCR. 50

جدول ‏3‑1: میزان زنده­مانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست درون­تنی موش.. 55

جدول ‏3‑2:  میزان زنده­مانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست برون­تنی موش. 63

فهرست اشکال

شکل ‏1‑1: مراحل مختلف تکوین پیش از لانه­گزینی در موش.. 2

شکل ‏1‑2: بخش­های مختلف لوله­ی تخم­بر. 3

شکل ‏1‑3: فرایند گامت­زایی. 4

شکل ‏1‑4: اسپرم و تخمک پستانداران. 5

شکل ‏1‑5: قطبیت رویان موش. 6

شکل ‏1‑6: تقسیم مرحله­ی 8 به 16 سلولی. 7

شکل ‏1‑7: تشکیل حفره­ی بلاستوسل. 7

شکل ‏1‑8: آرایش سیستم­های انتقالی در سلول­های تروفواکتودرم 8

شکل ‏1‑9: بلاستوسیست در حال خروج از زونا 9

شکل ‏1‑10: مسیر تمایز رده تروفواکتودرم در موش. 10

شکل ‏1‑11: جدایی دو رده سلولی اندودرم اولیه و اپی­بلاست در سه مرحله 11

شکل ‏1‑12: دخالت مسیر پیام­رسان FGF/MAPK 13

شکل ‏1‑13: فرایند شیشه­ای شدن محیط انجماد. 21

شکل ‏1‑14: روش­های مختلف سوراخ کردن مصنوعی حفره­ی بلاستوسل. 24

شکل ‏2‑1: قفس­های دارای سیستم تهویه­ی مجزا 26

شکل ‏2‑2: پتری دیش استحصال اسپرم 27

شکل ‏2‑3: جابجایی مهره­های گردنی. 28

شکل ‏2‑4: تشریح موش نر 29

شکل ‏2‑5: جمع­آوری اسپرم 30

شکل ‏2‑6: نحوه­ی جمع­آوری اسپرم­های زنده از حاشیه­ی قطره­ی محیط کشت.. 30

شکل ‏2‑7: نحوه­ی ترزیق داخل صفاقی موش.. 31

شکل ‏2‑8: پتری دیش استحصال تخمک.. 32

شکل ‏2‑9: جداسازی لوله­ی تخم­بر. 33

شکل ‏2‑10: جداسازی توده­ی تخمک-کومولوس.. 34

شکل ‏2‑11: پتری دیش IVF. 34

شکل ‏2‑12: تخمک-کومولوس­های مجزا 35

شکل ‏2‑13: نحوه­ی قطره­گذاری محیط KSOM در پلیت کشت رویان. 36

شکل ‏2‑14: جداسازی لوله­های رحمی. 38

شکل ‏2‑15: استحصال بلاستوسیست از لوله­ی رحمی. 39

شکل ‏2‑16: پتری دیش ریز دستکاری. 40

شکل ‏2‑17: نحوه­ی سوراخ کردن حفره­ی بلاستوسیست.. 41

شکل ‏2‑18: نحوه­ی قطره­گذاری محلول­های انجماد شیشه­ای. 42

شکل ‏2‑19: موقعیت قرار گیری بلاستوسیست بر روی کرایوتاپ 43

شکل ‏2‑20: پتری دیش حاوی محلول یخ­گشایی. 44

شکل ‏3‑1: بلاستوسیست­های درون­تنی موش بعد از انجماد-ذوب در محیط KSOM.. 56

شکل ‏3‑2: الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز. 57

شکل ‏3‑3: منحنی استاندارد ژن­های Grb2، Gata6 و B2m 58

شکل ‏3‑4: منحنی تکثیر ژن­های Grb2، Gata6 و B2m. 59

شکل ‏3‑5: منحنی­های ذوب مربوط به ژن­های Grb2، Gata6، B2m. 60

شکل ‏3‑6: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Gata6. 61

شکل ‏3‑7: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Grb2. 62

شکل ‏3‑8: مراحل مختلف رشد و تکوین رویان موش پیش از لانه­گزینی. 63

شکل ‏3‑9: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Gata6. 64

شکل ‏3‑10: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Grb2 65

چکیده فارسی

مطالعات انجام شده در سال­های اخیر نشان می­دهند که سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست قبل از انجماد شیشه­ای، در بهبود کیفیت رویان­های ذوب شده موثر است. اما در این مطالعات، به نقش آب درون حفره و تاثیر آن بر روی تشکیل رده­های سلولی بلاستوسیست، توجه نشده است. بنابراین در تحقیق حاضر، علاوه بر ارزیابی نرخ زنده­مانی و خروج از زونا، اثر کاهش مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه­ای، بر روی میزان بیان ژن­های Gata6 و Grb2 در بلاستوسیست درون­تنی و برون­تنی منجمد-ذوب شده و سوراخ شده قبل از انجماد بررسی شد و با گروه کنترل مقایسه گردید. در این مطالعه، میزان خروج از زونا با سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست قبل از انجماد، به­صورت     معنی­داری افزایش یافت. این در حالی است که میزان زنده­مانی در گروه­های تحت تیمار، مشابه با گروه کنترل، بالا بود. انجماد شیشه­ای موجب افزایش در میزان بیان ژن­های Gata6 و Grb2 شد (p<0.05). اما با کاهش مایع بلاستوسل قبل از انجماد، در بلاستوسیست­های درون­تنی، میزان بیان این ژن­ها نسبت به گروه انجماد شیشه­ای به­صورت معنی­داری کاهش پیدا کرد و به گروه کنترل نزدیک شد (p<0.05). در حالی که در مورد بلاستوسیست­های برون­تنی، با استفاده از این تکنیک، بیان ژن Grb2 افزایش پیدا کرد ولی تفاوت معنی­داری در میزان بیان ژن Gata6 نسبت به گروه انجماد شیشه­ای ایجاد نشد. از   آن­جایی که هیچ نتیجه­ای مبنی بر تاثیر منفی استفاده از این تکنیک مشاهده نگردید و با توجه به افزایش میزان خروج از زونا، کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه­ای می­تواند مفید واقع شود.

کلمات کلیدی: لقاح آزمایشگاهی، انجماد شیشه­ای، سوراخ کردن مصنوعی، بیان ژن، Real Time PCR

مقدمه و مروری بر مطالعات انجام شده

تکوین قبل از لانه­گزینی[1]، در همه­ی پستانداران با یک سلول منفرد به نام تخم[2] آغاز می­شود و با ایجاد بلاستوسیست[3] از طریق چندین تقسیم متوالی، پایان می­یابد (Rossant and Tam, 2009). مطالعه در مورد رخداد­های این دوره، برای افزایش موفقیت در تکنیک­های کمک باروری[4] الزامی است. بیشتر اطلاعات ما درباره­ی تکوین قبل از لانه­گزینی، از مطالعه بر روی موش بدست آمده است. از مزایای استفاده از موش می­توان به تعداد نژادهای بسیار زیاد، تشابه ژنتیکی بالا با انسان، ارزان بودن گونه­ی موش نسبت به سایر گونه­ها، دوران بارداری کوتاه، تعداد زیاد نوزادان در هر دوره­ی بارداری، سایز کوچک و نگهداری آسان اشاره کرد. بر همین اساس، استفاده از این مدل آزمایشگاهی در تحقیقات مربوط به فرایند­های تولیدمثلی و تکنیک­های کمک باروری رایج می­باشد.

تعداد صفحه : 103

قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09199970560        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

شماره کارت :  6037997263131360 بانک ملی به نام محمد علی رودسرابی

11

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید