دانلود پایان نامه:توسعه تست آویدیته الایزا با استفاده از پروتئینهای نوترکیب برای تمایز عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسما

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

گرایش :میکروبیولوژی

عنوان : توسعه تست آویدیته الایزا با استفاده از پروتئینهای نوترکیب برای تمایز عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسما

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد علوم دارویی

دانشکده علوم و فناوریهای نوین، گروه زیست شناسی

 

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد (M.Sc.)

گرایش: میکروبیولوژی

 

عنوان:

توسعه تست آویدیته الایزا با استفاده از پروتئینهای نوترکیب برای تمایز عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسما

استاد راهنما:

جناب آقای دکتر مجید گلکار

 

استاد مشاور:

سرکار خانم دکتر زرین تاج ولدخانی

 

سال تحصیلی 93-1392

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                صفحه                                  چکیده                                                                                                                                       1 مقدمه                                                                                                                                       3        فصل اول: کلیات1-1- اتصال ونفوذ توکسوپلاسما گوندی به سلول..................................................................................           121-2-راه انتقال                                                                                                   131-2-1-مصرف مواد انگل آلوده به اووسیست.........................................................................................           141-2-2-مصرف گوشت حاوی کیست نسجی...........................................................................................           151-2-3-انتقال از طریق جفت  ...................................................................................................................           151-3- همه گیر شناسی عفونت توکسوپلاسمایی.....................................................................................           161-3-1-عوامل موثر در همه گیر شناسی توکسوپلاسما گوندی.........................................................           181-3-1-1-عوامل مربوط به انگل................................................................................................................           181-3-1-2-عوامل مربوط به میزبان............................................................................................................           181-3-1-3-عوامل مربوط به محیط.............................................................................................................           191-4-آنتی ژنهای توکسوپلاسما گوندی......................................................................................................           191-5-واکسیناسیون ........................................................................................................................................   211-6-بیماریزایی                                                                                                  221-7-توکسوپلاسموزیس مادرزادی..............................................................................................................           241-8-تظاهرات بالینی .....................................................................................................................................           251-9-تشخیص توکسوپلاسموز......................................................................................................................           291-9-1- تشخیص مستقیم...........................................................................................................................             291-9-1-1-تشخیص هیستولوژی (بافت شناسی.....................................................................................             291-9-1-2- جداسازی توکسوپلاسما گوندی............................................................................................             301-9-1-3-تکنیک واکنش زنجیری پلیمراز (PCR1-15-2-تشخیص غیر مستقیم..................             301-9-2-تشخیص غیر مستقیم .....................................................................................................................            311-9-2-1- تست رنگی سابین – فلدمن.................................................................................................             341-9-2-2- سنجش آنتی بادی فلوئورسنت غیر مستقیم....................................................................             341-9-2-3- تست سنجش آگلوتیناسین ایمنوسوربنت.........................................................................             351-10-الایزا (ELISA)..................................................................................................................................             351-10-1- الایزای مستقیم ..........................................................................................................................             361-10-2- الایزای غیر مستقیم...................................................................................................................             361-10-3- الایزای ساندویچ...........................................................................................................................             371-10-3-1-الایزای ساندویچ مستقیم......................................................................................................             371-10-3-2-الایزای ساندویچ غیر مستقیم..............................................................................................             371-10-4- الایزای رقابتی یا مهاری.............................................................................................................             371-11-کاربرد پروتئین های نوترکیب در تشخیص توکسوپلاسماَ.......................................................             381-12-تولید پروتئین نوترکیب....................................................................................................................             391-13-تشخیص سرولوژی توکسوپلاسموزیس در دوران حاملگی......................................................             391-14-ارزش تشخیصی ایزوتایپ های مختلف ایمونوگلوبولیناختصاصی توکسوپلاسما در تشخیص عفونت............................................................................................             401-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزیس...........................             421-16-درمان                                                                                                      441-17-پیشگیری                                                                                                  471-18- بیان مسئله و اهمیت آن.................................................................................................................             481-19- دلایل انتخاب موضوع .....................................................................................................................             501-20-اهداف و فرضیا ت ............................................................................................................................             51فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته                             2-1- مروری بر تحقیقات گذشته .............................................................................................................................  53فصل سوم: مواد و روشها3-1- تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی ..........................................................................             593-1-1-مکانیسم تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی......................................................             593-1-2- تهیه و تخلیص پروتئین های  نو ترکیب rGRA7 (pUET-GRA7) وrGRA6(PUET-GRA6 ..............................................................................................................................             603-2- بررسی و تائید پروتئین های تخلیص شده...................................................................................             623-2-1- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE             623-2-2- تائید هویت پروتئین بیان شده با روش وسترن بلات...........................................................            663-3- دیالیز نمونه های تخلیص شده.........................................................................................................             713-4- تعیین غلظت پروتئین........................................................................................................................             713-5- سیستم های الایزا(اصول کار) .........................................................................................................             713-5-1- طراحی سیستم های الایزا...........................................................................................................             723-5-1-1- نکات تکنیکی در الایزا............................................................................................................             723-5-1-2- برخی مشکلات در الایزا.........................................................................................................             743-6- بررسی پتانسیل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخیص عفونت حاد و مزمن ...توکسوپلاسموز با روش الایزا..........................................................................................................................             763-6-1-برقراری شرایط الایزا.......................................................................................................................             763-6-2- استفاده از لیزات باکتری در الایزا      ....................................................................................             763-7- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم     ..........................................             773-8-تعیین Cut off  در روش الایزا ........................................................................................................             803-9- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun .......................................             813-10- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun ....................................             823-11- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index IgG .......................................             823-12- اندازه گیری IgG Avidity Index  با استفاده از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 وPUET-GRA6                                                                                                   833-13- اندازه گیری IgG Avidity Index  با استفاده از کیت تجاری EUROIMMUN  .....             833-14- اندازه گیری IgG Avidity Index  با استفاده از کیت تجاری Microgen.....................             853-15- محاسبه اندکس اویدیته نسبی (RAI) Relative avidity Index ....................................             883-16- کنترل کیفی .....................................................................................................................................             883-16-1- حساسیت .....................................................................................................................................             883-17-طراحی تحقیق     ............................................................................................................................             883-18- تعداد نمونه و روش نمونه گیری  ...............................................................................................             893-18-1- تعداد نمونه ..................................................................................................................................             893-18-2- روش نمونه گیری........................................................................................................................             89فصل چهارم: نتایج آزمایشات4-1 :تهیه و تخلیص پروتئین های  نو ترکیب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6(PUET-GRA6                                                                                                   924-2- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات ...............................................             934-3- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun                 944-3-1- نتیجه آزمایشات IgG ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرمهایایرانی با کیت Euroimmun........................................................................................................................... .           954-3-2- نتیجه آزمایشات IgM ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun        954-3-3-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرم هابا کیت Euroimmun  ....................................................................................................................................            964-4- برقراری شرایط ELISA  Avidity با پروتئین های نوترکیب  ..............................................           1004-5- نتایج آزمایش Avidity ELISA  با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA6 برای تمایزعفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار............................................................................................           1034-6- نتایج آزمایش Avidity ELISA  با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA7 برای تمایزعفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار ایران  ................................................................................           1034-7- بررسی نتایج ناهمخوان بین الایزا اویدیته با پروتئین های GRA6 وGRA7 و کیتEuroimmun با استفاده از کیت Microgen...........................................................................................           104فصل پنجم:بحث، پیشنهاداتمنابع                                                                                                                                       121خلاصه انگلیسی   ......................................................................................................            127ضمائم                                                                                                                                      129فهرست جداولعنوان                                                                                                                   صفحهجدول3-1: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن..........................................................................            87جدول 4-1: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon.........            97جدول 4-2: بررسی نتایج ناهم خوان با کیت های Microgen,Euroimmun و پروتئین هایGRA6 وGRA7     .....................................................................................................................................           106جدول شماره 4-3: نتایج آزمایش IgG وIgG Avidity با پروتئین های GRA6 و GRA7بر روی سرم های زنان باردار ............................................................................................................... ..... 108فهرست شکل هاعنوان                                                                                                                   صفحهشکل1-1- شکل شماتیک یک تاکی زوایت و یک برادی زوایت توکسوپلاسما گوندی ..............              4شکل1-2- عکس میکروسکوپ الکترونی یک تاکی زوایت، سوش  VEGکه در حالنفوذ به یک نوتروفیل صفاق موش می باشد..............................................................................................              7شکل1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیماندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش......................................................................................................              8شکل1-4- یک کیست بافتی توکسوپلاسما که حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد.......              9شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط..................             16شکل 1-6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی...............................................            25شکل 1-7- شکل شماتیک انواع الایزا.......................................................................................................             38شکل3-1:نوارهای کیت میکروژن................................................................................................................             87شکل 4-1  : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایلی ............................................             92شکل 4-2: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی ...............................................             93شکل 4-3: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7تخلیص شده باروش وسترن بلات ..............................................................................................................             94شکل 4-4 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسمادر آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 ....................................................................................           101شکل 4-5 :  تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمنعفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6..............................................           101شکل 4-6 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسمادر آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7......................................................................................           102شکل 4-7 :  تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمنعفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7...............................................           102شکل4-8: مدلی از بلوغ آنتی بادی های IgG به آنتی ژن های توکسوپلاسمای............................           105شکل 4-9: نتایج کیت میکروژن................................................................................................................................. 106شکل4-10: مقایسه اجرای تست Avidity با کیت Euroimmun و پروتئین GRA6 برای افتراقعفونت حاد و مزمن و تحت حاد.................................................................................................................           107 

چکیده فارسی

توکسوپلاسموزیس که توسط انگل اجباری درون سلولی توکسوپلاسما گوندی، ایجاد می شود. در افرادی که از سیستم ایمنی سالمی برخوردارند، عفونت اولیه معمولاً بدون علائم ویا با عوارض خفیفی همراه است، ولی در نوزادانی که عفونت را به طور مادرزادی دریافت کرده اند، ممکن است منجر به عوارض خطرناکی مثل عقب ماندگی ذهنی، کوری و یا حتی مرگ شود. بنابراین تشخیص صحیح عفونت اخیر (recent) توکسوپلاسما و تمایز آن از عفونت مزمن در زنان باردار، اهمیت حیاتی در مراقبتهای درمانی مادر و جلوگیری از بروز عوارض عصبی- مغزی در جنین دارد. از آنجایی که پاسخ آنتی بادی های IgM در درصد قابل ملاحظه ای از افراد، ماه ها یا حتی سال ها پس از کسب عفونت، مثبت باقی می ماند، تمایز صحیح میان عفونت حاد و مزمن به ویژه در زنان باردار، اهمیت فوق العاده ای دارد. در حال حاضر، بنظر می رسد ترکیب دو روش الایزای IgM و الایزای آویدیته IgG بهترین و مطمئن ترین نتایج را برای تشخیص عفونت حاد و تمایز آن از عفونت مزمن می دهند.  شرایط بهینه روش IgG avidity ELISA برای تمایز سرم ها از عفونت حاد ومزمن با استفاده از دو پروتئین GRA7 وGRA6  برقرار (develop) شد. در نهایت ،کارایی روش avidity ELISA با استفاده از دو پروتئین فوق برای تشخیص عفونت حاد و مزمن در زنان باردار بررسی شد. در این تحقیق از کیت استاندارد Microgen جهت مقایسه نتایج ناهمخوان مابین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 وGRA7 استفاده شد، نتایج بدست آمده از کیت Microgen دقیقا شبیه با پروتئین های نوترکیب بود. دراین تحقیق از 21 سرم حاد و 28 سرم مزمن و 29 سرم تحت حاد زنان مبتلا به توکسوپلاسما که حاد و مزمن وتحت حاد بودن آن با استفاده از تست های استاندارد سرولوژیک برای ما مشخص شده بود استفاده شد . از21 سرم حاد در آویدیته الایزا با پروتئین GRA6 ، تنها 1 سرم آویدیته بالا  داشت و از 28 سرم مزمن ، 2سرم آویدیته پایین داشت و از 29 سرم تحت حاد 5 سرم آویدیته پایین داشتند. در آزمایش با پروتئین GRA7 از 21 سرم حاد، 1 سرم  آویدیته بالا داشتند و از 28سرم مزمن همه سرم ها آویدیته بالا داشتند و از 29 سرم تحت حاد ، 6 سرم آویدیته پایین داشتند.همچنین در این تحقیق تعدادی از سرم ها که نتایج ناهمخوانی ما بین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7داشتند را با استفاده از کیت استاندارد Microgen بررسی کردیم که نتایج این کیت استاندارد شبیه پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7بخصوص پروتئین GRA6 بود که این یافته ها کارایی بهتر GRA6 را نشان می دهد. استفاده از آنتی ژنهای نوترکیب به جای آنتی ژنهای توتال انگل در کیت تشخیصی آویدیته الایزا ممکن است منجر به افزایش کارایی آنها شده و استانداردسازی کیتها را نیز تسهیل کند.کلمات کلیدی : توکسوپلاسما،گوندی ،آویدیته الایزا ، GRA7 ،GRA6

مقدمه

تاریخچه و طبقه بندی

انگل توکسوپلاسما گوندی[1]، یکی از اعضای شاخه اپی کمپلکسا، راسته کوکسیدیا، انگل اجباری درون سلولی بوده که بیماری توکسوپلاسموزیس را ایجاد می کند.این انگل با گسترش جهانی، قادر به تکثیر در بسیاری از میزبان های مهره دار از جمله انسان است. این ارگانیسم در سال 1908 توسط نیکول و مانسو[2] در یک جونده کوچک به نام کتنوداکتیلوس گوندی[3] در انستیتو پاستور تونس و تقریباً به طور همزمان توسط اسپلندور[4] در برزیل در یک خرگوش آزمایشگاهی کشف شد. ابتدا تصور می شد این ارگانیسم گونه ای از جنس لیشمانیا  است ولی یک سال بعد، پس از مطالعات بیشتر آن را به عنوان یک ارگانیسم متفاوت شناختند و نام جنس جدید توکسوپلاسما را برای آن پیشنهاد کردند)1و2(. اگرچه توکسوپلاسما گوندی عوارض متعددی در انسان بوجود می آورد ولی 15 سال بعد از کشف آن بود که انگل از اتوپسی چشم یک کودک مبتلا به هیدروسفالی جدا شد)3و4(. شیوع توکسوپلاسموزیس تا قبل از ابداع روش تشخیص سرولوژیکی تست رنگی[5] به وسیله سابین و فلدمن[6] در 1948 )5(، به طور دقیق  مورد ارزیابی قرار نگرفت. فرنکل[7] در سال 1970 چرخه زندگی را به طور کامل شناسایی و معرفی کرد )1(. موقعیت تاکسونومیک توکسوپلاسما گوندی بر اساس خصوصیات شکل شناسی و چرخه انگلی آن به وسیله ملهورن[8] در سال 1988 به صورت زیر تعریف شده است.Kingdom: ProtozoaPhylum: ApicomplexaClass: Sporozoea Sub-class: CoccidiaSuper- order: EucoccideaOrder: EucoccididaSub- order: EimeriinaFamily: EimeriidaeGenus: ToxoplasmaSpecies: gondiiتعداد صفحه : 145قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید