دانلود پایان نامه:جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری­های اندوفتیک گیاه گندم و بررسی اثرات آنتاگونیسمی آن­ها علیه پاتوژن­های قارچی گیاه

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست­ شناسی

گرایش :میکروبیولوژی

عنوان : جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری­های اندوفتیک گیاه گندم و بررسی اثرات آنتاگونیسمی آن­ها علیه پاتوژن­های قارچی گیاه

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد دامغان

دانشکده: علوم پایه

 

پایان­نامۀ برای دریافت درجه­کارشناسی­ارشد (M.Sc) در رشته زیست­شناسی، گرایش میکروبیولوژی

 

عنوان:

جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری­های اندوفتیک گیاه گندم و بررسی اثرات آنتاگونیسمی آن­ها علیه پاتوژن­های قارچی گیاه

استاد راهنما:

دکترحمید­رضا پردلی

 

استاد مشاور:

دکترمجید مقبلی

اسفند 1392

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

                                                   فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                   صفحهفصل اول: (مقدمه و اهداف تحقیق)چکیده فارسی                                                                                                 11-1-مقدمه............................................................................................................................ 21-2-اهداف تحقیق................................................................................................................ 3فصل دوم (مروری بر تحقیقات انجام شده)2-1-گیاه­شناسی گندم و اهمیت آن......................................................................................... 42-1-1- بیماری زنگ  ......................................................................................................... 52-1-2- بیماری سیاهک........................................................................................................   62-1-3- بیماری پاخوره یا پوسیدگی­ریشه یا از­پای­افتادن........................................................... 72-1-4- بیماری سوختگی­زرد یا لک­خرمایی............................................................................ 82-1-5- بیماری لکه­چشمی.................................................................................................... 92-1-6- بیماری ارگوت                                                                                     92-1-7- بیماری­های فوزاریومی.............................................................................................. 102-1-7-1- قارچFusarium graminarum........................................................................................................   122-1-7-2- قارچ Fusarium culmurum .......................................................................................................... 132-1-7-3- قارچ Fusarium avenaceum.........................................................................................................   132-1-7-4- قارچFusarium equiseta      .......................................................................................................... 142-1-7-5- قارچFusarium nivale                                                                                          152-2- میکروارگانیسم­های ریزوسفر                                                                         152-3- اندوفیت و کلونیزاسیون   ............................................................................................. 182-4- باکتری­های اندوفتیک و کاربرد آن­ها...............................................................................   212-4-1- افزایش تولید هورمون­های گیاهی...............................................................................   212-4-2- تثبیت بیولوژیکی نیتروژن..........................................................................................   252-4-3- فیتوبیورمیدیشن........................................................................................................   282-4-4- انحلال فسفات.........................................................................................................   392-4-5- تولید سیدروفور.......................................................................................................... 412-4-6- تولید آنتی­بیوتیک و آنتی­بیوزیس.................................................................................. 442-5- باکتری­های اندوفتیک و تولید آنزیم................................................................................... 512-6- تنوع و جمعیت میکروارگانیسم­های یافت شده به­عنوان اندوفتیک......................................... 53فصل سوم (مواد و روش­ها)3-1- جداسازی و کشت باکتری اندوفتیک.................................................................................. 593-1-1- مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری­های اندوفتیک از گیاه­گندم................ 593-1-2- روش کار................................................................................................................... 593-1-2-1- نمونه و نمونه­گیری.................................................................................................. 593-1-2-2- کشت و شناسایی.................................................................................................... 603-2-شناسایی فنوتیپی باکتری­های اندوفتیک................................................................................ 603-2-1-رنگ­آمیزی گرم........................................................................................................... 603-2-2- تست کاتالاز.............................................................................................................. 613-2-3- تست سیتوکروم­اکسیداز............................................................................................... 613-2-4- تست کوآگولاز........................................................................................................... 613-2-5- تست حرکت............................................................................................................. 623-2-6- تست هیدرولیز­ژلاتین.................................................................................................. 623-2-7- تست سیمون­سیترات................................................................................................... 633-2-8- تستMR/VP................................................................................................................ 633-2-9- تست هیدرولیز­نشاسته................................................................................................. 633-2-10- تست هیدرولیز­کازئین............................................................................................... 643-3- شناسایی باکتری­های تولید­کننده ترکیبات ضد­قارچی به روش مولکولار................................. 643-3-1- مواد و وسایل مورد استفاده جهت استخراج DNA......................................................... 643-3-2- روش استخراج DNA ژنومی....................................................................................... 653-3-3- روش تهیه ژل آگارز یک درصد................................................................................... 653-3-4- انجامPCR.......................................................................................................................... 663-3-4-1- وسایل مورد استفاده برای انجام PCR و شرایط دمایی دستگاه ترموسایکلر.................. 66فصل چهارم (نتایج و بحث)4-1- جداسازی باکتری­های اندوفتیک از گیاه­گندم....................................................................... 674-2- شناسایی فنوتیپی باکتری­های اندوفتیک                                                               684-3- ارزیابی اثر آنتاگونیسمی باکتری­های اندوفتیک برعلیه قارچ­های بیوکنترلی و قارچ­های پاتوژن  گیاهی..................................................................................................................................... 704-4- بررسی فعالیت آنزیم β-1و4­گلوکاناز............................................................................... 764-4-1- مواد و وسایل لازم...................................................................................................... 764-4-2- روش تهیه محلول نمکی 1­مولار.................................................................................. 764-4-3- ترکیبات محیط CMCآگار1%....................................................................................... 774-4-4 معرف آزمایش کنگورد.................................................................................................. 774-4-5 کشت و بررسی............................................................................................................ 774-5- نتایج مربوط به شناسایی مولکولی باکتری­ها........................................................................ 774-5-1- آنالیز کیفی محصولات PCR....................................................................................... 784-5-2- نتایج تعیین توالی........................................................................................................ 78فصل پنجم (نتیجه­ گیری)5-1. نتیجه گیری..................................................................................................................... 925-2پیشنهادات......................................................................................................................... 98منابع و ماخذ............................................................................................................................ 99چکیده انگلیسی......................................................................................................................... 109فهرست جداول
عنوان جدول                                                                                                          صفحه
جدول2-1. مشخصه­هایی از بیماری زنگ......................................................................................................5
جدول2-2. مشخصه­هایی از بیماری سیاهک..................................................................................................6
جدول2-3. انواع میکوتوکسین فوزاریومی....................................................................................................12
جدول2-4. انواع ترشحات ریشه..................................................................................................................18
جدول2-5. اندوفیتیک­های تثبیت­کننده نیتروژن............................................................................................28
جدول2-6. میکروارگانیسم­های مولد اسید­آلی..............................................................................................32
جدول2-7. میکروارگانیسم­های مولد بیوسورفاکتانت...................................................................................33
جدول2-8. میکروارگانیسم­های مولد گلیکوپروتئین.....................................................................................34
جدول2-9. میکروارگانیسم­های اکسید­کننده و احیاء­کننده.............................................................................35
جدول2-10. میکروارگانیسم­های دخیل در فیتوبیورمیدیشن.........................................................................39
جدول2-11. میکروارگانیسم­های مولد سیدروفور........................................................................................43
جدول2-12. اندوفیت­های مولد آنتی­بیوتیک و عملکرد آن­ها.......................................................................50
جدول3-1. شرایطPCR...............................................................................................................................66
جدول3-2. چرخهPCR................................................................................................................................66
جدول3-3. توالی پرایمرطراحی شده برای16S rRNA.................................................................................66
جدول4-1. نتایج آزمون­های بیوشیمیایی......................................................................................................68
جدول4-2. اسامی قارچ­های مورد آزمون.....................................................................................................71
جدول4-3. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Fusarium moniliforme.................................................................72
جدول4-4. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Fusarium graminearum..............................................................72
جدول4-5. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهFusarium oxysporum....................................................................72
جدول4-6. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Fusarium culmorum....................................................................72
جدول4-7. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Tricoderma virida........................................................................73
جدول4-8. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Tricoderma harizanum................................................................73
جدول4-9. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه.Tricoderma asperellum...............................................................73
جدول4-10. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Macrophomina phaseolina......................................................73
جدول4-11. ترکیبات محیط CMCآگار1%..................................................................................................76
جدول4-12. نتایج Blast.............................................................................................................................79
 فهرست شکل­ها
عنوان شکل                                                                                                          صفحه
شکل2-1. انواع زنگ­ها.................................................................................................................................6
شکل2-2. انواع سیاهک­ها.............................................................................................................................7
شکل2-3. بیماری پاخوره..............................................................................................................................8
شکل2-4. بیماری سوختگی­زرد­برگ.............................................................................................................8
شکل2-5. بیماری لکه­چشمی........................................................................................................................9
شکل2-6. بیماری ارگوت...........................................................................................................................10
شکل2-7. بیماری جرب و پوسیدگی فوزاریومی........................................................................................11
شکل2-8. ماکروکنیدی فوزاریوم­گرامیناروم.................................................................................................13
شکل2-9. ماکروکنیدی فوزاریوم­کلموروم...................................................................................................13
شکل2-10. ماکروکنیدی فوزاریوم­اوناسئوم.................................................................................................14
شکل2-11. ماکروکنیدی فوزاریوم­اکوئیست................................................................................................14
شکل2-12. عملکرد PGPR.......................................................................................................................17
شکل2-13. عملکردPGPB.........................................................................................................................24
شکل2-14. متانوتروف­های اندوفتیک.........................................................................................................38
شکل2-15. متابولیت­های ثانویه اکتینوباکتر­ها.............................................................................................44
شکل2-16. کلونیزاسیون اندوفیت­ها...........................................................................................................54
شکل3-1. کیت استخراج DNA شرکت سیناژن..........................................................................................64
عنوان شکل                                                                                                          صفحه
شکل4-1. رنگ­آمیزی گرم..........................................................................................................................67
شکل4-2. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله 2g51 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه...............74
شکل4-3. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله 1g61 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه...............74
شکل4-4. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله G13 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه................75
شکل4-5. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله G14 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه................76
شکل4-6. محصول PCR............................................................................................................................78
شکل4-7. هم­تراز­سازی توالی نمونه 2g51............................................................................................... 80
شکل4-8. سکانس­ژنی16srRNA نمونه 2g51...........................................................................................81
شکل4-9. هم­تراز­سازی توالی نمونه 1g61................................................................................................83
شکل4-10. سکانس­ژنی 16srRNA نمونه 1g61.......................................................................................84
شکل4-11. هم­تراز­سازی توالی نمونه G13...............................................................................................86
شکل4-12. سکانس­ژنی 16srRNA نمونه G13.........................................................................................87
شکل4-13. هم­تراز­سازی توالی نمونه G14................................................................................................89
شکل4-14. سکانس­ژنی 16srRNA نمونه G14.........................................................................................90
 

چکیده:

باکتری­های اندوفتیک به باکتری­های اطلاق می­شود که در درون بافت گیاهی بدون ایجاد آسیب ظاهر­ی زندگی می­کنند. امروزه بسیاری از محققین گیاهان را برای جداسازی و شناسایی اندوفیت­ها مورد ارزیابی قرار می­دهند زیرا برخی از آن­ها قادر به تولید ترکیبات ضد­قارچی و ضد­باکتریایی می­باشند و برخی به عنوان بارور­کننده به رشد گیاهان کمک می­کنند و ممکن است منفعت­هایی نیز برای گیاه به همراه داشته باشند که از آن جمله می­توان به داشتن اثر ضد­باکتری و ضد­قارچی آن ها اشاره کرد و اخیرا توجه بسیاری را به خود معطوف کردند زیرا استفاده و به کارگیری اندوفتیک­ها به جای استفاده از بارورکننده­ها و مواد میکروب­کش شیمیایی کمک به سزایی را به حفظ سلامت و محیط­زیست می­نماید بر همین اساس در تحقیق حاظر ابتدا جداسازی باکتری­های اندوفتیک از ریشه و ساقه گیاه گندم بر روی محیط کشت NA صورت گردید و سپس نمونه­ها از نظر توانایی تولید اثر آنتاگونیسمی علیه 5 پاتوژن قارچی :Fusarium moniliforme، Fusarium graminearum، Fusarium oxysporum، Macrophomina phaseolina، Fusarium culmorom (LM 2091) و 3 قارچ بیوکنترلی: Tricoderma virida (222-35) Tricoderma harizanum (115)، Tricoderma asperellum (Fyt222.2) در شرایط آزمایشگاهی با روش کشت­متقابل مورد مطالعه قرار گرفتند. در مجموع 69 باکتری از ریشه و ساقه گیاه گندم جداسازی گردید که از بین تمامی باکتری­های جداشده تنها 5 باکتری اثر آنتاگونیسمی نشان دادند بعضی از سویه­ها پس از تعیین توالی16srRNA تحت عنوان باسیلوس­سوبتلیسM.CH.V، باسیلوس­سوبتلیس IRI، باسیلوس­سوبتلیس Khazar و لیزنی­باسیلوس­ماکروئیدس Tethys شناسایی شدند. بنابراین مطالعه حاظر نشان داد که گیاه گندم حاوی باکتری­های اندوفیتیکی می­باشد که اثر ممانعتی علیه پاتوژن­های گیاه داشته است.کلمات کلیدی : اندوفتیک، گندم، آنتاگونیست، بیوکنترل، 16srRNA

 فصل اول

مقدمه واهداف تحقیق

1-1. مقدمهتازه ترین تعریف اندوفیت­ها « باکتری یا قارچی» است که برای تمام یا بخشی از زندگی خود به بافت­های گیاهان زنده حمله می­کنند. درمعنای تجربی، اندوفتیک­ها باکتری­های جدا شده از درون گیاه هستند که هیچ مشخصه یا نشانه­ای از بیماری ایجاد نمی­کنند .(Wilson; 1995)باکتری­های اندوفیتیک در یک جایگاه اکولوژیکی شبیه به پاتوژن­ها کلونیزه می­شوند اما با میکروارگانیسم­های پاتوژن گیاه تفاوت دارند، چون در گیاه بیماری ایجاد نمی­کنند و با میکروارگانیسم­های (روی گیاه) که درسطح بافت و اندام گیاهی زندگی می­کنند نیز تفاوت دارند که به عنوان عوامل موثر بیوکنترلی شناخته شده­اند.(Hallmann et al;1997)  تا به حال اکثر اندوفتیک­های جدا شده از گیاه، قارچ هستند. اندوفیت­ها در همه جا حضور دارند و ازتنوع زیستی غنی هستند بیش از 300000 گونه گیاهی بر روی زمین وجود دارد که هر گونه گیاهی، میزبان یک یا چند اندوفیت است. تخمین زده شده که بیش از یک میلیون گونه اندوفتیک مختلف وجود دارند که تنها تعداد انگشت شماری از آنها شرح داده شده است (Sadrati et al; 2013, Stępniewska and Kuźniar; 2013).تفاوت در تجمع اندوفیت­ها در بافت­های مختلف نشان دادند که برخی از اندوفیت­ها به بافت­های خاصیت مایل دارند که این ممکن است بازتابی از ظرفیت آنها برای استفاده و یا زنده ماندن در یک محیط خاص باشد.(Dauod et al; 2013) جمعیت اندوفیتک­ها توسط تعدادی از فاکتور­های بیولوژیکی ومحیطی مثل : نوع گیاه، سن گیاه، نوع بافت، زمان نمونه­برداری، شرایط محیطی خاک تحت تاثیر قرار می­گیرد(Stępniewska and Kuźniar; 2013 ,Conn and Franco; 2003) علاوه براین ژنوتیپ گیاه می­تواند جمعیت میکروبی ریزوسفر را تحت تاثیر قرار دهد، بنابر این جمعیت اندوفیت­ها در شرایط کلون شدن تحت تاثیر ژنوتیپ گیاه قرارمی­گیرد (Smith and coodman; 1999, Stępniewska & Kuźniar; 2013) که استرس­های پاتوژنی نیز اثر قابل توجهی در جمعیت اندوفتیک­ها نسبت به ژنوتیپ گیاه دارند (Reiter. et al ; 2002) علاوه بر این­ها، مسیر­های متابولیکی میکروبی نیز نقش مهمی در تنوع اندوفیت­ها بازی می­کنند(Stępniewska & Kuźniar;2013). یکی از فاکتور­هایی که به مقدار زیاد روی تنوع جمعیت اندوفیت­ها اثر می­گذارد، تغییرات جغرافیایی است که در آب و هوای معتدل، تجمع اندوفیتیک غنی­تر از نواحی گرمسیری و سرد جهان است(Fisher et al; 1995 , Arnold and Lutzoni; 2007) قبلا بر این باور بودند که اندوفیت­ها از تکامل میتوکندری و کلروپلاست در سلول گیاهی و بعد زمینه ژنتیکی شبیه به میزبان شکل گرفته­اند در حالی که بعدا بر این باور شدند که اندوفیت­ها از بیرون به درون گیاه از طریق سطح ریشه زخمی و یا ایجاد کانال وارد می­شوند(Zhenhua et al; 2012).اندوفیت­ها می­توانند با گیاه رابطه داشته باشند و همچنین می­توانند به گیاهان دیگر کلون شوند و علاوه بر این می­توانند باعث افزایش مقاومت میزبان در برابر عوامل مختلف زنده و غیر­زنده­ای که تحدید­کننده هستند بشوند و نقش مهمی در کنترل بیولوژیکی و ترویج رشد گیاه و همچنین افزایش متابولیت­های فعال زیستی دارندZhenhua et al; 2012)).باکتری­های اندوفتیک می­توانند مولکول­های کوچک اندولی مثل: ایندول­استیک­اسید، ایندول­گلایسین را تولید کنند که هورمون­های رشدی گیاه را سنتز کرده و به بهبود رشد گیاه کمک می­کنند. متابولیت­های فعال زیستی بدست آمده از میکروب­ها یا اندوفتیک­ها با خاصیت، ضدمیکروبی، ضدویروس، ضدسرطان، آنتی­اکسیدان، ضددیابت و سیستم ایمنی کشف شدند(Chiristiana et al; 2013) که علاوه برای این اندوفیت­ها به عنوان منبع مناسبی از میکروارگانیسم­ها و ژن به شمار می­روند (Zhenhua et al; 2012).تعداد صفحه : 125قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید