دانلود پایان نامه:کلون سازی نمونه ی جهش یافته ی Rice nsltp2 با هدف کاهش خاصیت آنتی ژنی و افزایش کارآمدی زیستی آن

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

گرایش :بیوتکنولوژی-میکروبی

عنوان : کلون سازی نمونه ی جهش یافته ی Rice nsltp2 با هدف کاهش خاصیت آنتی ژنی و افزایش کارآمدی زیستی آن

موسسه ی آموزش عالی نوردانش

دانشکده علوم پایه

 

گروه زیست شناسی

پایان نامه ی کارشناسی ارشد

 

رشته ی زیست شناسی

گرایش بیوتکنولوژی-میکروبی

 

تحت عنوان:

کلون سازی نمونه ی جهش یافته ی Rice nsltp2 با هدف کاهش خاصیت آنتی ژنی و افزایش کارآمدی زیستی آن

 برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)فهرست مطالبعنوان                                                                                                       صفحهفصل اول: مقدمه
  • تاریخچه ی پروتئین LTP ..........................................................................................................................1
1-2-ساختار ژنی LTP  ها......................................................................................................................................31-3- ساختار پروتئینی LTP...................................................................................................................................51-3-1- LTP1.....................................................................................................................................................61-3-2 LTP2-......................................................................................................................................................81-3-3- بررسی ارتباط ساختاری LTPو انتقال گروه های هیدرو فوب..................................................................101-4-بررسی خاصیت آنتی ژنی LTPها...................................................................................................................111-5-نقش های فیزیولوژیکی LTP..........................................................................................................................131-5-1 -نقش LTP  در سنتز کوتیکول.....................................................................................................................131-5-2-نقش LTP  ها به عنوان تعدیل کننده های رشد وتوسعه ی گیاهی................................................................131-5-3- نقش LTPها در دفاع مقابل عوامل ضد میکروبی........................................................................................141-6-کاربردهای LTP............................................................................................................................................151-6-1-بررسی کاربرد LTP در سیستم تحویل دارویی............................................................................................151-6-2 -کاربرد LTP در حسگر های زیستی ..........................................................................................................171-7- هدف تحقیق...................................................................................................................................................171-8- ضرورت انجام تحقیق......................................................................................................................................17فصل دوم: موادوروش ها 2-1- تجهیزات و دستگاه های مورد استفاده...............................................................................................................182-2- مواد مصرفی و نحوه ساخت..............................................................................................................................192-3- بخش آزمایشگاهی..........................................................................................................................................212-4- سویه های باکتری استفاده شده........................................................................................................................212-5- ناقل های استفاده شده.......................................................................................................................................212-6-طراحی وسنتز ژن nsLTP2 برنج ایرانی...........................................................................................................222-7- شرایط استریل کردن........................................................................................................................................252-8-محیط کشت لوریا برتانی (LB)........................................................................................................................252-9- آنتی بیوتیک...................................................................................................................................................262-10- شرایط کشت و نگهداری سویه های باکتری اشرشیا کلی.................................................................................262-10-1- طرز تهیه استوک گلیسرول........................................................................................................................262-11- استخراج ناقل................................................................................................................................................262-11-1- استخراج ناقل با روش لیز قلیایی..................................................................................................................262-11-1-1- روش انجام استخراج ناقل با روش لیز قلیایی.............................................................................................282-11-2- استخراج ناقل با استفاده از کیت شرکت بیو بیسیک.....................................................................................302-11-2-1- روش انجام استخراج ناقل با استفاده از کیت شرکت بیوبیسیک................................................................312-12- الکتروفورز DNA بر روی ژل آگارز............................................................................................................322-12-1- مواد لازم جهت الکتروفورز DNA بر روی ژل آگارز................................................................................322-12-1-1- بافر TAE............................................................................................................................................322-12-1-2- بافر TBE............................................................................................................................................332-12-1-3-تهیه ژل آگارز.......................................................................................................................................332-12-1-4- نشانگر اندازه DNA............................................................................................................................342-12-1-5-رنگ سایبر گرین..................................................................................................................................352-12-1-6- بافر بارگذاری.......................................................................................................................................362-12-2- تعیین اندازه و غلظت DNA توسط الکتروفورز..........................................................................................362-12-3- تخمین غلظت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر............................................................................362-13- تهیه سلول های مستعد از باکتری اشرشیاکلی با روش شیمیایی..........................................................................372-13-1- مواد لازم..................................................................................................................................................372-13-2- تهیه سلول مستعد.......................................................................................................................................382-14- ترانسفورماسیون با روش شوک گرمایی..........................................................................................................382-14-1- روش انجام ترانسفورماسیون.......................................................................................................................392-15- هضم آنزیمی با آنزیم های محدود کننده........................................................................................................402-15-1- مواد لازم برای هضم آنزیمی با آنزیم های محدود کننده..............................................................................402-15-1-1- آنزیم (Thermo scientific) XhoI...............................................................................................422-15-1-2- آنزیم (Thermo Scientific) NcoI...............................................................................................422-15-1-3 آنزیم BpiI (Thermo Scientific)..................................................................................................422-16- خالص سازی DNA از ژل............................................................................................................................422-16-1- مواد لازم برای  خالص سازی DNA از ژل................................................................................................432-16-2- روش انجام استخراج DNA از ژل............................................................................................................432-17- تکنیک الحاق................................................................................................................................................442-17-1-مواد لازم برای تکنیک الحاق......................................................................................................................442-17-2- روش انجام تکنیک الحاق..........................................................................................................................452-18- واکنش کلنی PCR......................................................................................................................................452-18-1- روش انجام واکنش کلنی- PCR..............................................................................................................452-19- تعیین توالی ژن rice-nsLTP2....................................................................................................................472-20-مطالعات بیوانفورماتیکی.................................................................................................................................472-20-1-نرم افزار ها و سرورهای مورد استفاده..........................................................................................................472-20-2-برر سی توالی nsLTP2............................................................................................................................482-20-3-بررسی هیدروفوبیسیته یnsLTP2  برنج ایرانی..........................................................................................492-20-4-بررسی خاصیت آنتی ژنیسیتی nsLTP2 برنج ایرانی ..................................................................................502-20-5-Molecular Docking.........................................................................................................................51فصل سوم:نتایج3-1-استخراج ناقل های pET26b  و pUC57  با روش لیز قلیایی ........................................................................523-2-نتایج هضم آنزیمی ناقل pET26b  وقطعه ی nsLTP2  جهش یافته................................................................533-3-نتایج خالص سازی از ژل..................................................................................................................................543-4-واکنش الحاق..................................................................................................................................................553-5-ترانسفورماسیون ناقل pET26b  نوترکیب ایجاد شده......................................................................................563-6-غربالگری ناقل های  pET26b حاوی ژن nsLTP2 جهش یافته....................................................................573-6-1-واکنش کلنی-PCR...................................................................................................................................573-6-2-نتایج استخراج ناقل های  pET26b نوترکیب.............................................................................................583-6-3- نتایج هضم آنزیمی ناقل نوترکیب...............................................................................................................593-6-4-نتایج تعیین توالی قطعه ی وارد شده به ناقل pET26b.................................................................................603-7-نتایج بخش بیوانفورماتیک................................................................................................................................613-7-1- بررسی ساختار اول پروتئین nsLTP2 برنج ...............................................................................................613-8- جهش زایی پروتئین nsLTP2 برنج ایرانی و Molecular Docking.........................................................67فصل چهارم:بحث و نتیجه گیری4-1 –کلیات............................................................................................................................................................684-2- مقایسهnsLTP2   و nsLTP1 ......................................................................................................................694-3- سنتز ژن جهش یافته  nsLTP2 گیاه برنج ایرانی ..............................................................................................704-4 -همسانه سازی ژن جهش یافته ی nsltp2 برنج ایرانی.........................................................................................714-5- بررسی نوع وحشی و جهش یافته nsLTP2 گیاه برنج ایرانی.............................................................................714-6- بررسی خاصیت آنتی ژنیسیتی nsLTP2 گیاه برنج ایرانی.................................................................................724-7- نتیجه گیری کلی..............................................................................................................................................744-8- پیشنهادات جهت تحقیقات آینده......................................................................................................................75فهرست شکل هاعنوان                                                                                                                          صفحهشکل1-1-تصویر شماتیک ناحیه ی کد کننده ی ژنLTP2  گیاه برنج ایرانی...............................................................5شکل1-2-بررسی توالی  nsLTP1 و nsLTP2 در برخی از گیاهان.........................................................................5شکل1-3-الگوی تشکیل چهار نوع پیوند دی سولفیدی در دو نوع LTP موجود در گیاه برنج....................................6شکل1-4-توالی و ساختار LTP1..............................................................................................................................8شکل 1-5-توالی و ساختار LTP2............................................................................................................................9شکل1-6-نمای کلی از وجود ساختار های ثانویه ی آلفا هلیکس در ساختار LTP1 و LTP2...................................9شکل 1-7-تطابق اسید آمینه ای آلرژن های LTP....................................................................................................12شکل1-8-برهمکنش ترکیبات مختلف از جمله کلسترول وانواع LTP ،...................................................................16شکل2-1-دیاگرام شماتیک نقشه ی ژنتیکی pET26b............................................................................................22شکل 2-2-دیاگرام شماتیک نقشه ی ژنتیکی pUC57.............................................................................................23شکل2-3-توالی ژنی طراحی شده ی  nsLTP2 برنج ایرانی......................................................................................24شکل2-4-اندازه نمایDNA...................................................................................................................................35شکل2-5-نمایی شماتیک از واکنش ترانسفورماسیون...............................................................................................40شکل3-1-نتایج استخراج ناقل با کیت استخراج پلازمید شرکت بیوبیسیک................................................................53شکل3-2-نتایج هضم آنزیمی...................................................................................................................................54شکل3-3-بررسی کیفیت قطعات استخراج شده از ژل...............................................................................................55شکل 3-4-نتایج تهیه ی سلول های مستعد................................................................................................................56شکل3-5-نتایج ترانسفورماسیون ناقل pET26b......................................................................................................57شکل 3-6-نتیجه ی  کلونی- PCR  .......................................................................................................................58شکل 3-7-استخراج ناقل pET26b نوترکیب.........................................................................................................59شکل3-8-بررسی هضم آنزیمی ناقل نوترکیب..........................................................................................................60شکل3-9-نتیجه  ی توالی یابی جهش های F39A  و L28A ................................................................................61شکل3-10-بخش های غشاء گذر و هیدروفوب پروتئین nsLTP2  با روش TMHMM........................................63شکل3-11-نواحی هیدروفوب توالی پروتئینی nsLTP2 با روش Sliding Widow..............................................64شکل 3-12-. میانگین میزان  آنتی ژنیسیته ی آمینو اسید های توالی پروتئینی nsLTP2 در حالت طبیعی.............65شکل3-13- میانگین میزان  آنتی ژنیسیته ی آمینو اسید های توالی پروتئینی nsLTP2 در توالی جهش یافته......................65شکل3-14- ساختار شیمیایی LysoPC14  ...........................................................................................................67فهرست جدول هاعنوان                                                                                                                          صفحهجدول1-1- ساختار های LTP1  بررسی شده به وسیله ی NMR و کریستالوگرافی اشعه ی X.................................7جدول 2-1-تجهیزات و دستگاه های مورد استفاده....................................................................................................19جدول2-2-  فهرست مواد مورد استفاده....................................................................................................................20جدول 2-3- ترکیبات محیط کشت LB...................................................................................................................25جدول2-4- مواد لازم برای ساخت محلول I استخراج ناقل.......................................................................................27جدول 2-5-مواد لازم برای ساخت محلول II استخراج ناقل......................................................................................27جدول 2-6-مواد لازم برای ساخت   محلول III استخراج ناقل..................................................................................28جدول 2-7-مواد لازم برای ساخت محلول TE........................................................................................................28جدول 2-8-محتویات کیت استخراج ناقل بیوبیسیک................................................................................................30جدول 2-9 مواد لازم برای ساخت  بافر TAE10X.................................................................................................32جدول2-10- مواد لازم برای ساخت بافر TBE10X...............................................................................................33جدول 2-11-ترکیب بافر بارگذاری 6X..................................................................................................................36جدول 2-12- مواد لازم جهت تهیه سلول مستعد.......................................................................................................37جدول 2-13-غلظت آنتی بیوتیک برای انتخاب سویه ی مقاوم..................................................................................39جدول 2-14-ترکیبات لازم برای واکنش هضم آنزیمی دوگانه ب برای ناقل pET26b...........................................41جدول2-15-ترکیبات لازم برای واکنش هضم آنزیمی دوگانه برای ناقل pUC57 ..................................................41جدول 2-16-محتویات کیت استخراج DNA از ژل بیونیر.......................................................................................43جدول 2-17-ترکیبات لازم برای واکنش اتصال با استفاده از ناقل pET26b............................................................45جدول2-18-مواد مورد نیاز برای PCR...................................................................................................................46جدول 2-19-برنامه ی زمانی و دمایی واکنش کلنی PCR.......................................................................................47جدول2-20-نرم افزار ها و سرورهای مورد استفاده....................................................................................................48جدول 2-21-میزان هیدروفوبیسیته ی هر آمینو اسید..................................................................................................49جدول2-22-پارامتر های تنظیم شده در زمان Docking.........................................................................................51جدول3-1- ویژگی های فیزیکو شیمیایی nsLTP2  برنج ایرانی.............................................................................62جدول 3-2-موتیف ها و محل قرار گیری آن ها روی توالی nsLTP2 برنج ایرانی...................................................63جدول 3-3-نواحی آنتی ژن توالی پروتئینی nsLTP2  برنج ایرانی..........................................................................64جدول 3-4-نواحی آنتی ژنیک  موجود در توالی nsLTP2 برنج ایرانی که با MHC-II واکنش می دهد...............66جدول 3-5-نواحی آنتی ژن توالی پروتئینی nsLTP2  برنج ایرانی که اپی توپ های سلول B هستند.......................66جدول3-6-نتایج حاصل از جهش زایی پروتئین nsLTP2......................................................................................67جدول 4-1-میزان وقوع هر آمینو اسید در اپی توپ ها و پروتئین ها ..........................................................................73چکیده:nsLTP  های گیاهی پروتئین های کوچک،محلول و متصل شونده به لیپید هستند که در بسیاری از اعمال فیزیولوژیکی گیاه مثل انتقال فسفولیپید ها ، دفاع در برابر عوامل باکتریایی و قارچی و... شرکت می کنند.این پروتئین ها به دو خانواده ی LTP1(9kDa) وLTP2(7kDa) تقسیم میشوند که هر دو خانواده  دارای چهار باند دی سولفیدی است که حفره ی هیدروفوب متصل شونده به لیپید را ایجاد میکنند.در مقایسه با LTP1، مطالعات ساختاری کمتری روی LTP2 انجام گرفته است.حفره ی هیدروفوب LTP2  نسبت به LTP1  کوچکتر بوده اما انعطاف بیشتری دارد که سبب می شود LTP2 توانایی حمل گروه گسترده ای از لیپید ها از جمله ملکول های سخت استرول را داشته باشد.به دلیل عملکرد های  گسترده ی nsLTP2،استفاده از آن ها در سیستم تحویل دارو توجه زیادی را به خود جلب کرده است ، از طرفی ثبات قابل توجه  این پروتئین ها در مقابل پروتئولیز ودناتوراسیون حرارتی سبب ابجاد واکنش های آلرژیک می گردد.هدف از این مطالعه ایجاد جهش های F39A وL28A در جهت کاهش خاصیت آنتی ژنی و بهبود تمایل اتصالی nsLTP2 برنج ایرانی می باشد.توالی ژن جهش یافته ی  nsLTP2 برنج ایرانی پس ار سنتز در وکتور pET26b کلون گردید. همچنین مطالعات بیوانفورماتیکی در جهت بررس ساختار پروتئین ، نواحی هیدروفوب و ویژگی های آنتی ژنی پروتئین انجام شد.نتایج بررسی ها ی انجام شده در این پژوهش نشان داد که اعمال تغییرات ذکر شده در توالی nsLTP2 برنج ایرانی سبب کاهش خاصیت آنتی ژنی و همچنین افزایش کارایی آن در سیستم تحویل دارو می گردد.کلمات کلیدی:nsLTP2، دارو رسانی،ویژگی های آنتی ژنی،Oryza Sativa.

فصل اول

مقدمه

  • تاریخچه ی پروتئین LTP[1]
لیپید ها نقش ضروری را در بیولوژی دارند و به عنوان رابط بین اندامک ها،سلول ها و موجودات تعریف می شوند.این گروه از ملکول ها منبع غنی از انرژی را ارائه داده و می توانند به عنوان سیگنال های ملکولی و هورمونی مهم عمل کنند.لیپید های مورد نیاز قسمت های مختلف سلول های یوکاریوتی از جمله غشای پلاسمایی و غشای سایر اندامک ها در اندامک هایی همچون شبکه ی آندوپلاسمی و دستگاه گلژی ساخته و سپس به بخش های مورد نظر منتقل می شوند (Dowhen.1997;Jouhet et al .2007; Kent .1995;vance.2004).بدین ترتیب تبادل قابل توجهی از لیپید ها بین غشاهای سلولی مختلف وجود دارد که در یوکاریوت ها این پدیده از طریق مسیر های وزیکولی و غیر وزیکولی رخ می دهد( Maxfield and Mondal .2006).غشای اندامک هایی مثل گلی اکسی زوم ها شامل لیپید هایی مثل فسفاتیدیل کولین،فسفاتیدیل گلیسرول و فسفاتیدیل اتانول آمین است،در حالی که این اندامک فاقد آنزیم های مورد نیاز برای ساخت این فسفاتید ها می باشند.بنابراین این اندامک باید لیپید های لازم برای ساخت غشای خود رااز اندامک های سازنده ی آن وارد کند(Moreau et al . 1998).از طرف دیگر عموما لیپید ها دارای حلالیت ضعیفی در سیتوپلاسم سلول می باشند که این خود حضور یک سیستم انتقالی را ضروری می سازد.گروهی از پروتئین ها تحت عنوان انتقال دهنده ی لیپید(LTP) اولین بار از برگ های اسفناج استخراج شدند و بر اساس فعالیت و عملکردی که در انتقال فسفولیپید ها بین غشاها در حالت in vitro داشتند نامگذاری شدند (kader .1996). این پروتئین ها توانایی انتقال فسفولیپید ها،گلیکولیپید ها،اسید های چرب و استرول ها بین لیپید های غشایی از لیپوزوم ها یا میکروزوم ها به میتوکندری را دارند و در شرایط in vitro انتقال فسفولیپید ها را از یک غشای دهنده به یک غشای گیرنده تسهیل می کنند( kader (.1996;Yeast and Rose.2008).LTP  ها از جمله فراوان ترین پروتئین ها در گیاهان هستند و بیش از 4% حجم پروتئین های محلول را تشکیل می دهند( Carvaho and Gomes et al. 2007;Edstam et al. 2011).با توجه به فعالیت های واضح LTP های گیاهی در حالت in vitro  در ابتدا این طور فرض می شد که این پروتئین ها فقط در تبادل لیپید ها در درون سلول نقش دارند،اما این ایده زمانی که نشان داده شد که LTP ها به عنوان پیش پروتئین هایی دارای سیگنال پپتید تولید شده Bernhard et al. 1997)) ،که به طور مستقیم به ماتریکس خارج سلولی ترشح می شوند رد شد (Meijer et al.1993;Thoma et al.1993).این پروتئین ها تاکنون از گیاهان مختلفی همچون گندم،جو،گیلاس،آرابیدوپسیس،ذرت،لوبیا،سیب،هلو،گوجه،تاج خروس و برنج استخراج شده اند( Cheng Hui – chun et al.2004. LTP.( ها علاوه بر انواع مختلف گیاهان (Wang et al.2004) در باکتری ها ،حیوانات و همچنین بافت های انسانی نیز یافت می شوند.اگر چه از نظر توالی LTPهای گیاهی و جانوری هیچ تشابهی ندارند اما شباهت زیادی بین LTP  های گیاهی وجود دارد.در انواع مختلف ساختار گیاهی از جمله دیواره سلولی برگ،دمبرگ،ساقه،گل و دستجات آوندی LTP وجود دارد( Yeats and Rose . 2008)، این ملکول ها دارای PI حدود 10-8 می باشند. LTP ها قادر به انتقال طیف گسترده ای از لیپید ها از جمله انواع فسفولیپید ها،گلیکولیپید ها،استروئید ها و اسید های چرب بین غشاهای زیستی می باشند. بدین ترتیب دارای عملکرد غیر اختصاصی بوده و آنها را با نام عمومی [2]ns – LTP می شناسند. این پروتئین های قلیایی کوچک بر اساس وزن ملکولی خود به دو گروه nsLTP1 با وزن ملکولی 9 کیلو دالتون و nsLTP2 با وزن ملکولی 7 کیلو دالتون تقسیم می شوند(Karimian et al.2011). این دو نوع ملکول ویژگی های مشترکی از جمله نقطه ایزوالکتریک بالا،وزن ملکولی پایین،هشت باقی مانده بسیار حفاظت شده از سیستئین که در تشکیل باند های دی سولفید درون ملکولی دخالت می کنند را به اشتراک گذاشته اند( Arondel and Kader.2000 ).با این حال علی رغم تشابهات کلی تفاوت هایی در وزن ملکولی،توالی اسید آمینه ای و فعالیت های بیولوژیکی دارند. (Samuel et al. 2002)پروتئین های خانواده ی LTP1 دارای 90 تا 95 اسید آمینه و پروتئین های خانواده ی LTP2 دارای 70 اسید آمینه در ساختار اولیه خود می باشند. (Kader et al.1996) همچنین مطالعات کریستالوگرافی نشان داده که اختلاف در حفره ی هیدروفوب این دو پروتئین از مهمترین تفاوت های آنهاست.این حفره آب گریز در LTP1 به شکل یک تونل است که از محور ملکولی می گذرد و در LTP2 به صورت یک محفظه ی  خالی هرمی است که حفره آب گریز در LTP2 دارای اندازه کوچکتر و انعطاف بیشتری نسبت به LTP1 می باشد.به این ترتیب LTP2 با داشتن این ویژگی توانایی اتصال به ملکولهای سختی همچون استرول ها را دارد (Elmorjani et al .2004). LTP ها از هر دو خانواده LTP1  و LTP2  در انتهای آمینی خود سیگنال پپتیدی دارند که در LTP1 33-24 اسید آمینه و در LTP2 36-24 اسید آمینه دارد( Garcia  - Garrido et al .1998; Kalla et al .1994).مطالعات انجام شده در مورد LTP1 نسبت به LTP2 بیشتر است.در این مطالعات توالی نوکلئوتیدی و اسید آمینه ای،روند تخلیصی(Liu et al .2002; Padidar et al . 2009;Segura et al . 1993;Zaman et al . 2009)،فعالیت های زیستی مختلف از جمله فعالیت های انتقالی و اتصالیCheng Chao-sheng et al.2008))،خواص ضد قارچی و ضد میکروبی (Kirobakaran et al.2008 ;Yeats and Rose.2008 , Zottich et al.2011)و سایر خواص آن مورد بررسی قرار گرفته است.همچنین ویژگی های ساختاری این ملکولها توسط مطالعات بیوانفورماتیک(Lee et al . 1998) و تکنیک هایی از قبیل NMR و CD بررسی شده است. LTP ها دارای وظایف متعددی از جمله انتقال مونومر های کوتین،شرکت در مکانیسم دفاعی گیاهان،شرکت در روند تمایز سلولی،گرده افشانی،جوانه زنی و جنین زایی می باشد( Ekland and Edqvist et al .2003;Cheng Hui – Chun et al.2004). این پروتئین ها در برابر دمای بالا (تا 80 درجه)،ترکیبات دناتوره کننده و هضم آنزیمی مقاومند (Bernardi et al.2011)،ثبات قابل توجه در برابر پروتئولیز (Lindorff – Larsen and Winther.2007) و دناتوراسیون حرارتی ذاتا در ارتباط با خاصیت آلرژی زایی این پروتئین هاست (Breiteneder and Mills.2004)، به همین دلیل این پروتئین ها می توانند وارد سیستم هورمونی بدن انسان شوند و سیستم عصبی را تحریک کرده و به عنوان آلرژی عمل کنند(  Bernardi et al. 2011) .تعداد صفحه : 109قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید