دانلود پایان نامه ارشد:اپیدمیولوژی مولکولی پروتئینP2 غشای خارجی در هموفیلوس آنفلوانزا

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست فناوری

گرایش :میکروبی

عنوان : اپیدمیولوژی مولکولی پروتئین93P2 غشای خارجی در هموفیلوس آنفلوانزا

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد ارومیه

دانشکده علوم پایه گروه زیست شناسی

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد

 

رشته زیست فناوری(بیوتکنولوژی) گرایش میکروبی

عنوان:

اپیدمیولوژی مولکولی پروتئینP2 غشای خارجی در هموفیلوس آنفلوانزا

استاد راهنما:

آقای دکتر سید داور سیادت

استاد مشاور:

آقای دکتر سید فضل الله موسوی

 

شهریور1393

 برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)فهرست مطالبعنوان                       صفحهفصل اول: کلیات.. 11-1-تاریخچه وطبقه بندی: 21-2-مشخصات میکروسکوپی و ماکروسکوپی: 41-3- کشت: 41-4-آنتی ژنها وعوامل بیماریزایی.. 51-4-1-عوامل اتصالی فیمبریه ای: 71-4-2-سایرعوامل بیماریزائی: 101-5-بیماریها و عوارض.... 111-6- روش‏های تشخیص کلاسیک: 131-7-اپیدمیولوژی.. 141-7-1-جلوگیری از پنومونی.. 14فصل دوم: پیشینه پژوهش... 162-1- مقدمه. 172-2- تاریخچه. 18فصل سوم: روش شناسی.. 213-1- مواد و وسایل: 223-2- دستگاه ها: 243-3- محلول سازی: 253-3-1- آماده سازی محیط کشت: 253-3-2- محیط شکلات اگار: 263-3-3- آماده سازی ژل اگارز 1 درصد: 273-4- طراحی و روش اجرا: 273-4-1- جمع‏آوری نمونه: 273-5- کشت نمونه ها: 273-6- تست ‌های بیوشیمیایی: 283-7- رنگ آمیزی: 293-8- نگهداری ایزوله‌های بالینی هموفیلوس آنفلوانزا در شرایط کرایو در دمای -80ْ: 293-9- استخراج DNA.. 303-9-1-استخراج DNA به روش جوشاندن: 303-10- بررسی کیفیت و کمیت DNAاستخراج شده: 303-11- راه اندازی و انجام PCR: 313-12- واکنشPCR.. 323-13- الکتروفورز محصول PCR: 353-13-1- مواد و وسایل مورد نیاز: 353-13-2- نحوه تهیه ژل اگارز و انجام الکتروفورز: 353-14- تفسیر ژل الکتروفورز. 363-15- RFLP.. 363-15-1- استخراج باند اصلی از روی ژل اگارز. 373-15-2- بررسی غلظت محصولات تخلیص شده توسط دستگاه نانودراپ: 373-16- مواد و وسایل لازم برای RFLP: 373-16-1- روش انجام RFLP باآنزیمAlu1: 383-16-2- انجامRFLP باآنزیم محدودالاثر EcoR1: 383-17- تعیین توالی و پردازش داده ها: 383-17-1- ارسال نمونه‏ها جهت توالی یابی قطعه تکثیر شده: 39فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده ها 404-1- تعداد نمونه‏ها و ایزولاسیون: 414-2-تستهای بیوشیمیایی: 424-3-نتایج بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده: 424-4- PCRژن ompP2 ایزوله‌های بالینی هموفیلوس آنفلوانزا: 434-5- RFLP: 444-6: نتایج تعیین توالی (Sequencing) و ثبت توالی‌ها دردیتابیسGeneBank/EMBL: 454-7- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی نمونه ها: 464-7-1- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 3: 464-7-2. آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 5: 474-7-3- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 8: 484-7-4- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 35: 494-7-5- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 47: 504-7-5- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره14: 514-8- بررسی میزان شباهت و تفاوت ایزوله‌های بالینی تهران: 52فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری.. 565-1- آنالیز RFLP از ایزوله‌های بالینی: 575-2. آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 3: 575-2-1آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 5: 585-2-2- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 8: 585-2-3- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 35: 595-2-4- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 14: 605-2-5- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 47: 605-3- بحث: 61پیشنهادات: 66منابع. 67فهرست منابع. 68Abstract 75پیوست ها 76فهرست جداولجدول3-1- مواد تشکیل دهنده و مقدار حجم آنها برای  PCRاز ompP2. 34جدول 3-2- برنامه PCR برای تکثیر ژن ompP2. 34جدول3-3- توالی پرایمرهای مورد استفاده برای ompP2. 35جدول 4-1- اطلاعات نمونه‌های دریافتی از بیماران مورد مطالعه. 41جدول 4-2 نتایج بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده 42جدول 4-3- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 3 در NCBI 47جدول 4-4- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 5 در NCBI 48جدول 4-5- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 8 در NCBI 49جدول 4-6- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 35 در NCBI 50جدول 4-7- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 47 در NCBI 51جدول 4-8-. نتیجهBlast سکانس اسید نوکئیک شماره 14 در NCBI 52فهرست اشکالشکل1-1- ساختارشیمیایی پلی ریبوزیل ریبیتول فسفا ت... 3شکل1-3- کلو نی‌های هموفیلو س آنفولانزا روی محیط شکلات اگار. 5شکل3-1-تست کاتالاز. 29شکل 3-2- شکل باسیل گرم منفی هموفیلوس آنفلوانزا 30شکل 3-3- دستگاه ترموسایکلر. 34شکل 3-4- دستگاه الکتروفورز. 36شکل4-1- ژن ompP2 ایزوله‌های با لینی... 43شکل 4-2و4-3- جایگاه برش آنزیم محدودالاثر Alu1برای ژنompP2 ایزوله‌های بالینی... 44شکل 4-4- جایگاه برش آنزیم محدودالاثر ECOR1برای ژن  ompP2ایزوله‌های بالینی... 44شکل 4-5- کروماتوگرام به دست آمده از تعیین توالی ژن ompP2 نمونه شماره  14با پرایمر Forward.. 45شکل 4-6- کروماتوگرام به دست آمده از تعیین توالی ژن ompP2نمونه شماره  14با پرایمر Revers. 45شکل 4-7- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 3 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 46شکل 4-8- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 3.. 46شکل 4-9- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 5  با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 47شکل 4-10- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 5.. 47شکل 4-11- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 8 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 48شکل 4-12- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 8.. 48شکل 4-13- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 35 با اطلاعات ثبت شده در  Gene Bankو بررسی توالی اسیدآمینه آنها 49شکل 4-14- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 35.. 49شکل 4-15- آنالیزو مقایسه نمونه شماره  47با اطلاعات ثبت شده در  Gene Bankو بررسی توالی اسیدآمینه آنها 50شکل 4-16- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 47.. 50شکل 4-17- آنالیزو مقایسه نمونه شماره 14 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 51شکل 4-18- نواحی حفاظت شده پروتئین شماره 14.. 51شکل 4-19- مقایسه ساختمانی اسیدآمینه پروتئینP2 ایزوله‌های بالینی با همدیگر. 54فهرست نمودارهانمودار 4-1- نتایجRFLP 52نمودار 4-2- میزان درصد هر یک از الگو ها 53نمودار 4-3- درصد جهش ها 53چکیده:هموفیلوس آنفلوانزا،یک باکتری گرم منفی و پاتوژن اختصاصی انسانی است که از نظر بیماری زایی می‏تواند ایجاد مننژیت حاد باکتریایی ،سپتی سمی،اپی گلوتیت،باکتریمی،عفونت گوش میانی کند. هدف این مطالعه بررسی یکی از این پروتئین ها ی حفاظت شده در باکتری هموفیلوس آنفلوانزا به منظور طراحی واکسن بومی علیه ان می‏باشد. پروتئینP2  ، بین 38 الی 40 کیلودالتون وزن داشته و بیش از 50 درصد کل پروتئینهای غشاء خارجی هموفیلوس را شامل می‏گردد و غالبا توسط سویه‏های فاقدکپسول و سویه b هموفیلوس ها بیان می‏شود.این پروتئین به عنوان یک کاندیدای مناسب واکسن برای سویه‏های بدون کپسول هموفیلوس آنفلوانزا مطرح است. در این تحقیق ،اپیدمیولوژی ژن ompP2 با استفاده از نمونه‏های بالینی که از 30 بیمار جداسازی شده بودند،مورد بررسی قرار گرفت. باکتری ها در محیط شکلات اگار کشت داده شدند و تستهای بیوشیمیایی انها انجام شد. پس از تخلیص DNA،واکنش PCR انجام شد. همه نمونه ها از نظر وجود ژن ompP2) 1173(bp مثبت شدند. پس از تعیین توالی 6 نمونه و مقایسه توالی ژن ompP2 سویه‏های بومی با سویه‏های استاندارد و توالی موجود در بانک ژنی،با نرم افزار MEGA4 ،شباهت ها و تفاوت های ناشی از حذف ،اضافه و یا جابه جایی نوکلئوتیدی را نشان داد. جهت بررسی الگوی پلی مورفیسم ژن مورد نظر ،محصول PCR مورد هضم توسط آنزیم های Alu1 و EcoR1 قرار گرفتند. الگوی برش 21 نمونه (99%-98%) مشابه سویه‏های استاندارد باno:J3359. 1,M93268. 1,M93269. 1,M932701) (accessionبود و 9 نمونه (98%-91%) متفاوت بود. نتایج ما نشان دادکه ژن ompP2 از نظر سازماندهی ژنی،شبیه سویه‏های مختلف هموفیلوس آنفلوانزا ثبت شده در بانک ژنی است و در قسمت برش توسط آنزیم محدودالاثر Alu1دچار پلی مورفیسم شدند. لذا این پروتئین می‏تواند کاندید مناسبی برای واکسن باشد.واژگان کلیدی: هموفیلوس آنفلوانزا،واکسن،ژن ompP2،PCR.

فصل اول: کلیات

1-1-تاریخچه وطبقه بندی:هموفیلوس آنفولانزا اولین بار در پاندمی ‌ویروس آنفولانزا توسط فایفر[1] در سال 1892 معرفی شد ( (Murley et al, 1988 (Reddy et al, 1996. فایفر گزارش کرد در نمونه خلط بیماران مبتلا به آنفولانزا یک باکتری ناشناخته مشاهده شده، که نام آن را باسیل فایفر گذاشت و تا چندین سال تصور بر این بود که این باکتری عامل بیماری آنفولانزا است به همین خاطر به آن آنفولانزا نیز می‏گفتند. بعدها مشخص شد که این باکتری به عنوان یک عفونت ثانویه در دستگاه تنفسی مبتلایان به ویروس آنفولانزا مطرح است (Peltola H, 2000). چهل سال بعد از فایفر، پیتمن[2] نشان داد که هموفیلوس آنفولانزا می‏تواند به دو دسته کپسول‏دار و بدون کپسول تقسیم شود. وی شش تایپ پلی ساکارید کپسولی از این باکتری را بر مبنای خاصیت آنتی ژنیک آنها معرفی کرد که کپسول آنها مسئول ویرولانس ارگانیسم است. ساختار این کپسول‏ها بعدها شناسایی شد. این شش تایپ راa  تاf  نامیدند (;Cotter D et al, 2002 ;Murley  et al, 1998 (Murphy et al, 1993; Reddy et al, 1996 . (از بین این شش سروتایپ کپسول‏دار، سروتایپ b هموفیلوس آنفولانزا (Hib) تقریبا در 90 درصد موارد ابتلا، اصلی‏ترین عامل مننژیت باکتریایی در کودکان زیر 5 سال، عامل 95 درصد بیماری‏های مهاجم دیگری همچون باکتریمی، پنومونی و سپتی سمی‌ در کودکان و مسئول نیمی ‌از بیماری‏های مهاجم بزرگسالان همچون سلولیت، اپی‏گلوتیت، لارنژیت و ارتریت چرکی می‏باشد (;Haase et al, 1994  (Murphy et al, 1993.پیتمن همچنین مشاهده کرد که تمام سویه‏های جدا شده از مایع نخاعی و خون بیماران از تایپ b کپسول‏دار است (Reddy et al, 1996). عفونت سیستمی‌در کودکان توسط گونه‏های این باکتری در سراسر دنیا اتفاق می‏افتد و میزان شیوع آسیبهای نورولوژیک، این باکتری را به یک نگرانی عمومی ‌برای سلامت افراد تبدیل کرده‏است (; Haase et al, 1994  ( Murley et al, 1998.این باکتری توسط کپسول پلی‏ساکاریدی از جنس قند پنج کربنه (پنتوز) که پلی‏مری از واحدهای تکراری پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات [3] (PRP)می‌باشد، از فاگوسیتوز توسط ماکروفاژها محافظت می‏گردد (Reddy et al, 1996) ; Kubiet&Ramphal, 1995) .).تعداد صفحه : 129قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید