دانلود پایان نامه ارشد:جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های خاک‌زی مولد آنزیم ال-آسپارژیناز

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست‌شناسی سلولی

گرایش :میکروبیولوژی

عنوان :جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های خاک‌زی مولد آنزیم ال-آسپارژیناز

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد دامغان

گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی

 

پایان‌نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست‌شناسی سلولی و مولکولی گرایش میکروبیولوژی

 

عنوان :

جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های خاک‌زی مولد آنزیم ال-آسپارژیناز

 

استاد راهنما

دکتر حمیدرضا پردلی

شهریور 1393

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

فصل اول: کلیات 
چکیده فارسی1
مقدمه2
1-1 آنزیم ال-آسپاراژیناز4
1-2   میکرو ارگانیسم‌های تولید کننده‌6
1-3   مکانیسم تنظیم‌کننده ترشح آنزیم آسپاراژیناز10
1-4  کلاس‌های عمومی از ال-آسپاراژیناز11
1-5  روش تعیین سختی و ساختار ال-آسپاراژیناز12
1-6 ویژگی‌های ساختاری ال-آسپاراژیناز12
1-6-1ساختار مونومری آنزیم ال-آسپاراژیناز12
1-6-1-1 شرح جایگاه فعال ال-آسپاراژیناز14
1-6-2 ساختار تترامر آنزیم ال-آسپاراژیناز15
1-6-3 ساختار اُکتامر آنزیم ال-آسپاراژیناز17
1-7 انواع آنزیم ال-آسپاراژیناز برحسب منشأ جداسازی18
1-7-1-آنزیم‌های بومی18
1-7-1-1  ال-آسپاراژینازی از اشرشیا کلی18
1-7-1-2 ال-آسپاراژینازی از اروینیا19
1-7-2 آنزیم اصلاح‌شدهPEG)  -آسپاراژیناز)20
1-8  کاربرد ال – آسپاراژینازها22
1-8- 1  مکانیسم عمل به‌عنوان یک کمک‌کننده به فرآوری مواد غذایی23
1-8-2  مکانیسم عمل به‌عنوان یک دارو25
1-9 علم شیمی و فارماکولوژی برای دارو26
1-10 نیمه‌عمر دارو26
1-11 مسائل و رویکردهای مرتبط با استفاده درمانی از ال-آسپاراژیناز27
1-11-1 عوارض ایمونولوژیک27
1-11-2 مقاومت در برابر آسپاراژیناز27
1-11-3 سمیت دارو28
1-12 فارموکینیتیک29
فصل دوم : مروری بر تحقیقات انجام‌شده 
2_1 تحقیقات انجام‌شده در ایران و خارج از ایران32
2-1-1 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های خاکزی مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز32
2-1-2 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز به منظور بهینه سازی34
2-1-3 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با استفاده از محیط کشت اختصاصی M937
2-1-4 تحقیقات انجام شد بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با استفاده از روش نسلریزاسیون38
2-1-5 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز جدا شده ار آب و رسوبات39
2-1-6 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز بر اساس روش  SDS-PAGE39
فصل سوم: مواد و روش‌ها 
3-1 غربالگری سویه‌های مولد آنزیم از خاک42
3-2   جداسازی و کشت باکتری42
3-2-1   مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری از خاک42
3-2-2   کشت43
3-3   فعالیت آنزیم45
3-4 روش‌های اندازه‌گیری آمونیاک45
3-5    مواد و وسایل لازم بررسی فعالیت آنزیم45
3-6    معرف آزمایش46
3-7 خواندن جذب لوله‌های Test و Blank46
3-8 مراحل کلونینگ47
3-9  شرح مراحل کلونینگ48
فصل چهارم: نتایج 
4-1   نتایج مربوط به جداسازی60
4-1-1   نتایج کشت60
4-1-2   نتایج رنگ‌آمیزی گرم و تست‌های بیوشیمیایی61
4-1-3   نتایج بررسی فعالیت آنزیمی63
4-1-4 نتیجه آنالیز کیفی قطعه تکثیر یافته66
4-1-5  نتایج مربوط به مستعد سازی66
4-1-6 نتایج مربوط به کشت ماتریکس66
4-1-7 نتایج تست Quick- check67
4-1-8 نتایج استخراج پلازمید68
4-1-9 نتایج PCR تاییدی69
4-1-10  نتایج تعیین توالی نمونه   : Bacillus cereus strain69
4-1-11  نتایج تعیین توالی نمونه  : Bacillus thuringiensis strain74
4-1-12  نتایج تعیین توالی نمونه  : Oerskovia turbata79
فصل 5  نتایج 
5-1 نتیجه83
5-2 جمع بندی83
5-3 محدودیت ها83
5-4 پیشنهادها84
منابع85

 

فهرست جداول

جدول ‏1-1 تعدادی از میکروارگانیسم‌های تولیدکننده آسپاراژیناز7
جدول1-2 منابع میکروبی ال-آسپاراژیناز و خواص آن8
جدول1-3 مشخصات ال-آسپاراژیناز نشان‌دهنده فعالیت گلوتامیناز19
جدول1-4 خواص آنزیم‌های اشرشیا کلی و اروینیا و برخی از فرآورده‌های بومی و اصلاح‌شده20
جدول1-5 مقایسه‌ای از سمیت ال-آسپاراژیناز بومی و PEG29
جدول1-6. خواص برخی از ال-آسپاراژینازهای میکروبی31
جدول 3-1 مواد لازم جهت ساخت محیط کشت42
جدول 3-2 مقادیر مورد نیاز برای تهییه میکس PCR با در نظر گرفتن + n51
جدول 3-3   شرایط دمایی و زمانی مورد نیاز برای میکروتیوپ ها51
جدول 3-4 مقادیر اضافه شده به داخل میکروتیوپ 0/2 cc54
جدول 3-5 : میزان مواد اضافه شده به داخل میکروتیوپ در مرحله ی Quick-check57
جدول4-1  قطر هاله تشکیل‌شده توسط سویه‌ها روی محیط  برحسب میلی‌متر61
جدول4-2 رنگ‌آمیزی گرم نمونه‌های آنزیم مثبت62
جدول4-3 نتایج مربوط به آزمودن‌های بیوشیمیایی نمونه‌های آنزیم مثبت63
جدول4-4 جذب  نمونه های مولد آنزیم در طول‌موج 600 نانومتر64
جدول4-5  جذب نمونه‌های مولد آنزیم در طول‌موج 480 نانومتر72
جدول4-6  نتایج در سطح جنس و گونه80

 

فهرست نمودار ها

نمودار 1-1 طبقه‌بندی عمومی ازآسپاراژیناز11
نمودار 4 – 1 میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 600 تاتومتر64
نمودار 4- 2  میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 480 تاتومتر65

 

فهرست شکل‌ها

شکل 1-1  ساختار ال- آسپاراژیناز3
شکل ‏1- 2 ساختار سه‌بعدی یک آنزیم آسپاراژیناز تولیدشده توسط Yersinia pestis(شناسه PBD: 3NTX )6
شکل ‏1-3 شرح تصویری یک مدل مورفینی11
شکل 1-4  هم‌ترازی بین ال-آسپاراژیناز13
شکل1-5 توپولوژی از ال-آسپاراژیناز14
شکل1-6  تصویرسازی از زیر واحد A آنزیم14
شکل1-7  این کاریکاتور تشکیل دایمر بین مونومر A , C15
شکل1-8 باقی‌مانده سایت فعال و اسیدآسپارتیک (لیگاند)15
شکل1-9  اثرات متقابل در a , b با توجه به ارتباطات نزدیک در دایمر16
شکل1-10  ساختار تترامر ال-آسپاراژیناز17
شکل1-11 شکل نواری از آنزیم17
شکل ‏1-12 واکنش میلارد. شاخه Z در اسیدآمینه آسپاراژین، CH2CONH225
شکل ‏1-13نقش کاتالیزوری آنزیم آسپاراژیناز در شکستن آسپاراژین25
شکل1-14  مکانیسم عمل ال-آسپاراژیناز(نارتا و همکاران 2007)26
شکل3-1 محیط  MMYبراث44
شکل3-2 لوله‌های آماده‌شده جهت اسپکتروفتومتری46
شکل4-1 تغییر رنگ محیط کشت بر اثر تولید آنزیم61
شکل4-2مشاهده میکروسکوپی باکتری‌ها62
شکل4-3 محصول PCR مورد تائید برای کلونینگ66
شکل4- 4 رشد باکتری حاوی پلازمید نوترکیب روی محیط آمپی سیلین دار66
شکل4-5 گسترش باکتری نوترکیب روی محیط آمپی سیلین دار جدید67
شکل4 -6 کشت باکتری نوترکیب در LB برای PEX67
شکل4 – 7 ران کردن پلازمید نوترکیب از پلیت ماتریکس روی ژل1% –    8 R67
شکل4 – 8 ران کردن پلازمید نوترکیب از پلیت ماتریکس روی ژل1% – 5 R68
شکل4-9  پلازمید نوترکیب استخراج شده برروی ژل 1%68
شکل4-10 تکثیر قطعه هدف از روی پلازمید نوترکیب استخراجی69
شکل 4-11  هم تراز سازی توالی نمونه  5 R71
شکل 4-12 هم تراز سازی توالی نمونه ی  8 R77

چکیده فارسی

آنزیم آسپاراژیناز به‌طور عمده در پزشکی برای درمان لوسمی لنفوبلاستی حاد[1]  و در صنایع غذایی برای کاهش تولید اکریل‌آمید در مواد غذایی نشاسته داری که سرخ یا برشته می‌شوند کاربرد دارد. ازآنجاکه ال- آسپاراژیناز[2]  جداشده از باکتری‌های مختلف دارای اثرات ضد سرطانی متفاوتی بوده است، جستجو برای یافتن میکروارگانیسم‌های تولیدکننده این آنزیم، یکی از راه‌های اصلی جهت دستیابی به آنزیمی با خصوصیات درمانی ایده آل می‌باشد. هدف این تحقیق جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های تولیدکننده ال-آسپاراژیناز از خاک‌ بوده است. نمونه‌های خاک از منابع مختلف نظیر جنگل، مزرعه، باغچه گرفته‌شده و پس از تهیه سوسپانسیون روی محیط کشت کشت داده شدند. کلنی‌های تولیدکننده‌ی آنزیم ال-آسپاراژیناز ، بر اساس تغییر رنگ محیط از زرد به صورتی متمایز گردیدند. میزان فعالیت آن بر اساس روش نسلر موردبررسی قرار گرفت. باکتری‌های‌ تولیدکننده آنزیم دارای فعالیت مطلوب، پس از شناسایی بیوشیمیایی با روش مولکولی PCR مورد شناسایی قرار گرفتند و ‌توالی rRNA S 16نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. بر اساس نتایج بدست آمده ،  بهترین و بیشترین میزان تولید آنزیم توسط باکتری های باسیلوس تورنجسیس و باسیلوس سرئوس و Oerskovia turbata  می باشد. بنابراین مطالعه حاضر نشان داد نمونه های خاک حاوی باکتری های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز می باشد.

کلمات کلیدی: آسپاراژیناز ،لوسمی،باکتری‌های مولد، نمونه‌های خاک

فصل اول

کلیات

مقدمه

آنزیم‌ها به‌عنوان تسریع‌کننده‌های واکنش‌های شیمیایی نقش مهمی در شکل‌گیری حیات سلولی  به‌نحوی‌که امروزه می‌شناسیم  ایفا می‌کنند. به‌کارگیری هدفمند آنزیم‌ها به‌منظور مداخله در سیر واکنش‌های شیمیایی و بیوشیمیایی همواره یکی از موضوعات موردتوجه در صنعت و پزشکی بوده است( رائو، 1999)

باکتری‌ها از اصلی‌ترین منابع تولید آنزیم به شمار می‌رود.. در این تحقیق باکتری‌های جداشده از خاک‌های مناطق  مختلف استان گلستان (مزرعه، جنگل، باغ) ازنظر تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز خارج سلولی موردبررسی قرار گرفتند.

خاک یکی از مکان‌های عمده میکروارگانیسم‌ها محسوب می‌شود. فراوان‌ترین میکروارگانیسم‌ها در خاک، باکتری‌ها هستند. خاک باغچه در هر گرم محتوی میلیون‌ها باکتری است. درجاهای عمیق تعداد آن‌ها کاهش می‌یابد. قارچ‌ها به تعداد کمتر از باکتری‌ها در خاک یافت می‌شوند.( رائو، 1999)

مهم ترین گروه های باکتر ی های خاک عبارتند از :آرتروباکتر، استرپتومایسس ها ، سودوموناس، نیتروباکتریاسه،متانوموداسه،اسپیریلاسه،تیوباکتریاسه،اُ باکتریال ها ( که خود شامل گروه های ازتوباکتریاسه، ریزوبیاسه،آکروموباکتریاسه،میکروکوکاسه،کورینه باکتریاسه،باسیلاسه می باشد)، میکسوباکتریال ها، سیانوباکترها. (رائو،[3]1999 ).

ال-آسپاراژیناز (L-asparagine amidohydrolase, EC 3.5.1.1) آنزیمی است که اسیدآمینه ال-آسپاراژین  را به دو جزء آسپارتیک اسید[4]  و آمونیاک[5]  می‌شکند(رائو، 1999 )

شکل 1-1  ساختار ال آسپاراژیناز( سینگ و اسریواستاوا ،2012)

در حالت عادی، سلول‌های توموری قادر به تولید ال-آسپاراژین موردنیاز برای ادامه حیات سلول نیستند. بنابراین چنانچه این سلول‌ها با آنزیم ال-آسپاراژیناز تیمار گردند، به این دلیل که قادر به جایگزینی اسیدآمینه ال-آسپاراژین تخریب‌شده نمی‌باشند، به‌طور انتخابی از بین خواهند رفت بدون اینکه به سلول‌های سالم آسیب وارد گردد. ( سینگ و اسریواستاوا ،2012)آنزیم آسپاراژیناز در صنعت فرآوری مواد غذایی نیز برای تأمین معیار‌های مرتبط با سلامت مورداستفاده قرار می‌گیرد. ( سینگ و اسریواستاوا ،2012)

تعداد صفحه : 107

قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09361998026        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

شماره کارت :  6037997263131360 بانک ملی به نام محمد علی رودسرابی

11

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید