دانلود پایان نامه ارشد:طراحی و استقرار روش جدید سم زدایی سریع از واکسن سیاه سرفه

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

گرایش :میکروبیولوژی

عنوان : طراحی و استقرار روش جدید سم زدایی سریع از  واکسن سیاه سرفه

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد علوم دارویی

دانشکده علوم و فناوریهای نوین، گروه زیست شناسی

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد ((M.Sc))

گرایش: میکروبیولوژی

 

عنوان:

طراحی و استقرار روش جدید سم زدایی سریع از  واکسن سیاه سرفه

 

استاد راهنما:

جناب آقای دکتر عبدالرضا موحدی

 

اساتید مشاور:

جناب آقای دکتر اسماعیل اصلی

جناب آقای دکتر حسین عطار

سال تحصیلی 92-1391

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                              صفحهخلاصه فارسی .......................................................................................................................................................... 1فصل اول: کلیات1-1. بیان مسئله ............................................................................................................................................................ 31-2. تاریخچه بیماری سیاه سرفه ............................................................................................................................. 41-3. باکتریولوژی............................................................................................................................................................. 71-4. ترکیبات مهم باکتری سیاه سرفه ................................................................................................................ 101-4-1. توکسین پرتوسیس...................................................................................................................................... 101-4-2. فیلامنتوس هموگلوتینین (FHA)........................................................................................................ 121-4-3. فیمبریه و آگلوتینین ها............................................................................................................................. 131-4-4. پرتکتین.......................................................................................................................................................... 151-4-5. آدنیلات سیکلاز (ACT)......................................................................................................................... 161-4-6. تراکئال سایتو توکسین (TCT)............................................................................................................. 171-4-7. توکسین حساس به حرارت....................................................................................................................... 181-4-8. BrKA.......................................................................................................................................................... 181-4-9. اندوتوکسین................................................................................................................................................... 191-5. سویه های بوردتلا پرتوسیس ........................................................................................................................ 191-6. اپیدمیولوژی ....................................................................................................................................................... 201-6-1. وضعیت بیماری در ایران............................................................................................................................ 211-7. بیماری زایی سیاه سرفه  ............................................................................................................................... 211-8. علائم کلینیکی ................................................................................................................................................. 221-9. تشخیص بیماری ............................................................................................................................................... 231-9-1. تشخیص بالینی............................................................................................................................................ 231-9-2. علائم کلینیکی در نوزادان......................................................................................................................... 241-9-3. کودکان، نوجوانان و بزرگسالان................................................................................................................. 251-10. پاسخ ایمنی در برابر سیاه سرفه ............................................................................................................... 261-10-1. پاسخ ایمنی همورال................................................................................................................................. 271-10-2. پاسخ ایمنی سلولی.................................................................................................................................. 281-11. روش های آزمایشگاهی تشخیص............................................................................................................... 301-11-1. کشت............................................................................................................................................................ 301-11-2. سرولوژی..................................................................................................................................................... 301-11-3. PCR ........................................................................................................................................................ 321-12. مدیریت بیماری............................................................................................................................................... 331-13. پیشگیری ........................................................................................................................................................ 341-13-1. راهبردهای بالقوه در مهار بیماری سیاه سرفه در اوایل نوزادی.................................................... 351-13-1-1. واکسیناسیون بالغین و سالمندان................................................................................................... 371-13-1-2. حفاظت غیرمستقیم نوزادان از طریق واکسیناسیون والدین.................................................. 371-13-1-3. ایمن سازی نوزادان و کودکان......................................................................................................... 381-13-1-4. واکسیناسیون مادر در دوران بارداری............................................................................................ 381-14. استراتژی های واکسن................................................................................................................................... 391-14-1. واکسن غیر سلولی سیاه سرفه............................................................................................................. 391-14-2. واکسن سلولی سیاه سرفه...................................................................................................................... 40فصل دوم: مروری بر متون گذشته2-1. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه................................................................................................................ 422-1-1. تعریف تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) ............................................................................... 432-1-2. تعریف تست حفاظتی داخل مغزی موش (تست توانمندی Potency test) ........................ 442-1-3. ابداع روش کشت......................................................................................................................................... 442-1-4. جداسازی سلول باکتری از کشت............................................................................................................ 452-2. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه در انستیتو رازی................................................................................ 462-3. غیرفعال سازی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه....................................................................... 472-3-1. استفاده از فرمالین و تیومرسال برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه............. 472-3-2. استفاده از گلوتار آلدهید برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه......................... 492-3-3. استفاده از حرارت برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه...................................... 49فصل سوم: مواد و روش ها3-1. تجهیزات و وسایل ............................................................................................................................................ 513-2. مواد و محیط ها ................................................................................................................................................ 523-2-1. محیط کشت آگار بورده ژانگو................................................................................................................... 523-2-2. محیط کشت وِروِی...................................................................................................................................... 533-2-3. محیط B2...................................................................................................................................................... 543-2-4. محیط کشت سویابین کازئین.................................................................................................................. 543-2-5. محیط تیوگلیکولات براث.......................................................................................................................... 553-3. روش کار ............................................................................................................................................................. 563-3-1. انتخاب سویه های بوردتلا پرتوسیس..................................................................................................... 563-3-1-1. لیوفیلیزه کردن....................................................................................................................................... 563-3-2. کشت باکتری سیاه سرفه.......................................................................................................................... 563-3-2-1. کشت تجدید حیات روی محیط بورده ژانگو.................................................................................. 563-3-2-2. کشت بذر روی محیط وِروِی............................................................................................................... 573-3-2-3. مراحل انجام کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه....................................................................... 573-3-2-3-1. استریلیزاسیون فرمانتور.................................................................................................................. 573-3-2-3-2. آماده سازی و بهینه سازی محیط کشت فرمانتوری............................................................... 583-3-2-3-3. تلقیح بذر به محیط کشت در فرمانتور....................................................................................... 583-3-3. جداسازی باکتری سیاه سرفه از محیط کشت..................................................................................... 593-3-3-1. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سانتریفوژ............................................................................ 593-3-3-2. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سیستم میکرو فیلتراسیون........................................... 593-3-4. غیرفعال سازی سلول باکتری سیاه سرفه............................................................................................. 603-3-5. سمیت زدایی سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه.................................................................................. 603-3-5-1. سمیت زدایی با استفاده از فرمالین................................................................................................... 613-3-5-2. سمیت زدایی با استفاده از تیومرسال............................................................................................... 613-3-6. تست های کنترلی سوسپانسیون سیاه سرفه....................................................................................... 613-3-6-1. تست استریلیتی..................................................................................................................................... 613-3-6-2. تست کنترل غیرفعال بودن باکتری.................................................................................................. 623-3-6-3. تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) ....................................................................................... 623-3-6-4. تست توانمندی....................................................................................................................................... 62فصل چهارم: نتایج4-1. تجدید حیات بذر بر روی محیط بورده ژانگو............................................................................................. 644-2. تهیه بذر در محیط وِروِی................................................................................................................................ 644-3. کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن........................................................................ 644-4. جداسازی باکتری سیاه سرفه از کشت........................................................................................................ 674-5. غیرفعال سازی و سمیت زدایی باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن............................................. 694-5-1. سمیت زدایی با فرمالین............................................................................................................................. 694-5-2. سمیت زدایی با تیومرسال......................................................................................................................... 694-6. آزمایش های کنترلی سوسپانسیون های سیاه سرفه............................................................................... 694-7. نتایج حاصل از آزمون MWG در کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفهسمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال........................................................................................................... 724-8. آزمون MWG و مقایسه تغییرات اوزان موش ها................................................................................... 754-9. تست توانمندی واکسن های آزمایشی سیاه سرفه................................................................................... 80فصل پنجم: بحث و پیشنهاداتبحث ................................................................................................................................................................................ 83نتیجه گیری و پیشنهادات ........................................................................................................................................ 88منابع................................................................................................................................................................................ 89خلاصه انگلیسی ....................................................................................................................................................... 97ضمایم ............................................................................................................................................................................. 98 فهرست جداولعنوان                                                                                                                             صفحهجدول1-1. آنتی ژن های مختلف سیاه سرفه......................................................................................................... 9جدول1-2. علائم کلینیکی بیماری سیاه سرفه................................................................................................... 26جدول1-3. آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان سیاه سرفه حاد و رژیم مصرف آن.................... 34جدول1-4. واکسیناسیون سیاه سرفه در کشورهای مختلف............................................................................ 36جدول2-1. ترکیب محیط لیستر و B2  بر اساس گرم در لیتر....................................................................... 45جدول3-1. لیست دستگاه ها و تجهیزات مورد استفاده.................................................................................... 51جدول3-2. لیست مواد و محیط های مورد استفاده در تولید واکسن سیاه سرفه..................................... 52جدول3-3. ترکیبات محیط بورده ژانگو................................................................................................................. 53جدول3-4. ترکیبات محیط کشت وِروِی............................................................................................................... 53جدول3-5. ترکیبات محیط کشت B2.................................................................................................................. 54جدول3-6. ترکیبات محیط کشت سویابین کازئین........................................................................................... 55جدول4-1. اطلاعات دوره کشت باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن..................................................... 68جدول4-2. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باکتری  سیاه سرفه سمیت  زدایی شده با فرمالین.................................................................................................................................................. 70جدول4-3. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باکتری  سیاه سرفه سمیت  زدایی شده با تیومرسال............................................................................................................................................... 71جدول4-4. نتایج حاصل از کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال با استفاده از آزمون MWG.............................................................................................................................................................. 73جدول4-5. نتایج کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین با استفاده از آزمون MWG   76جدول4-6. نتایج کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با تیومرسال با استفاده از آزمون MWG 77جدول4-7. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV)     80جدول4-8. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال (TDV)  81 فهرست نمودارهاعنوان                                                                                                                صفحه نمودار1-1. مقایسه تعداد افراد زیر یک سال ایمن شده با واکسن DTP در سه کشور مختلف در سال2000 تا 2010 .......................................................................................................................................................... 6نمودار4-1. تغییرات pH کشت سویه 134 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور..... 65نمودار4-2. تغییرات pH کشت سویه 509 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور..... 65نمودار4-3. مقایسه­ی میانگین جذب نوری در طول موج های530 و590 در مقدار جرم  باکتری در هنگام برداشت در بچ های مختلف سویه 134 و 509.............................................................................................................................. 66نمودار4-4. مقدار غلظت نهایی باکتری سیاه سرفه (cell109×1) سویه 134 در پایان دوره کشت در هنگام برداشت   66نمودار4-5. مقدار غلظت نهایی باکتری سیاه سرفه (cell109×1) سویه 509 در پایان دوره کشت در هنگام برداشت   67نمودار4-6. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه  سویه 134  توسط  فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست MWG ......................................................................................................................................... 74نمودار4-7. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی  سیاه سرفه در سویه 509 توسط فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست  MWG......................................................................................................................................... 74نمودار4-8. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین نسبت به تیومرسال در سویه 134................................................................................................................................................................ 78نمودار4-9. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالیننسبت به تیومرسال در سویه  509...................................................................................................................... 78نمودار4-10. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با سوسپانسیون های سمیت زدایی شده سویه 134 با تیومرسال و فرمالین نسبت به موش های گروه کنترل.............................................................................................................. 79نمودار4-11. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده توسط واکسن سیاه سرفه حاصل از سمیت­زدایی با فرمالین وتیومرسال در سمیت زدایی درسوش509 توسط تست MWG ............................. 79نمودار4-12. مقایسه نتایج حاصل از توانمندی واکسن های تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV) با واکسن های تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال((TDV ................................................................................................ 81       فهرست اشکالعنوان                                                                                                                               صفحهشکل1-1. کوکوباسیل سیاه سرفه.............................................................................................................................. 7شکل1-2. اتصال بوردتلا پرتوسیس به سلول های پوشش مژه دار مجاری تنفسی...................................... 9شکل1-3. شمای شماتیک از پرتوسیس توکسین.............................................................................................. 11شکل3-1. فرمانتور استفاده شده برای کشت سیاه سرفه................................................................................. 58خلاصه فارسیسیاه سرفه بیماری عفونی باکتریال دستگاه تنفس است که عامل آن بوردتلا پرتوسیس از دسته باکتری های گرم منفی می باشد.  در این مطالعه شش بچ از سویه های 134 و 509 باکتری سیاه سرفه تهیه شده و مورد مقایسه قرار گرفتند. از دو روش فیزیکی سانتریفوژ و میکروفیلتراسیون برای جداسازی سلول باکتری از محیط کشت استفاده گردید. سپس سلول­های جداسازی شده باکتری درPBS  خنک و استریل در غلظت متوسط Ou/ml 150-100 حل شده و به دو قسمت تحت نام­های سوسپانسیون سمیت­زدایی با فرمالین (FD) و سوسپانسیون سمیت زدایی با تیومرسال (TD) تقسیم شدند. به سوسپانسیون هایFD  بعد از غیرفعال سازی در حرارت 56 درجه سانتیگراد بمدت 10 دقیقهmM  10فرمالین (7/37 %) اضافه گردید و به سوسپانسیون هایTD  در شرایط مشابه، بعد از غیرفعال سازی با حرارت، w/v 01/0 % تیومرسال بصورت محلول اضافه شد. سپس هر دو سوسپانسیون در دمای 8-4 درجه سانتیگراد برای سمیت زدایی انکوبه شدند. در روزهای 10، 30، 90، 180 و 270 از هر دو نوع سوسپانسیون نمونه برداری شد تا سمیت آنها با انجام تست افزایش وزن موش (MWG) مورد ارزیابی قرار گیرد. در نهایت نیز شش واکسن آزمایشی FD وTD  از مخلوط کردن غلظت های مشابه دو سویه 134 و 509 تهیه گردید تا بتوان توانمندی این واکسن ها را در تست حفاظتی موش با تستKendrick  ارزیابی نمود. نتایج حاکی از آن بود که روش سمیت زدایی با فرمالین با میانگین دوره  6/26 روز در مقایسه با روش سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین دوره 195 روز، روش کوتاهتری از نظر زمانی برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه است. توانمندی واکسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با فرمالین با میانگین 9/5 از واکسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین 95/5 قدری کاهش را نشان داده است. براساس نتایج حاصل، فرمالین با کاهش دوره سمیت زدایی در درجه حرارت 8-4 درجه سانتیگراد بمیزان 5/7 برابر بسیار مناسب تر از تیومرسال بود. اگرچه توانمندی واکسن حاصل از روش سمیت زدایی با تیومرسال حدود 05/0 واحد بیشتر از واکسن حاصل از سمیت زدایی با فرمالین است ولی تفاوت از نظر آماری ناچیز بود.کلیدواژه­ها: بوردتلاپرتوسیس- سمیت زدایی- تیومرسال- فرمالین- تست افزایش وزن موش (MWG) – تست حفاظتی موش با تست kendrik

فصل اول

کلیات

1-1. بیان مسأله

بیماری سیاه سرفه یک عفونت تنفسی بوده که توسط باکتری بوردتلا پرتوسیس[1] از دسته باکتری­های گرم منفی ایجاد می شود. نشانه عمده بیماری سرفه هایی است که ممکن است تا چند هفته نیز طول بکشد که مشخصه آن پاروکسیزمال[2] شدید با سرفه های ناگهانی است که اغلب خاتمه آن با یک دم همراه می باشد. بیماری در نوزادان و اطفال بیشتر رخ می دهد (2و18).در تولید واکسن سلولی سیاه سرفه به روش سنتی و جاری آن در مؤسسه واکسن و سرم سازی رازی جدا سازی باکتری به روش ترسیب با اسیدکلریدریک انجام گرفته و سپس به منظور سمیت زدایی[3] توکسین های موجود در سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه از تیومرسال و انکوباسیون درسردخانه به مدت طولانی 12-9 ماه استفاده می گردد. جدا سازی جرم باکتری با استفاده از اسید از یک سو و فرآیند طولانی     سمیت زدایی با مرتیولات از سوی دیگر منجر به کاهش توانمندی واکسن می گردد. لذا در این پروژه با جایگزینی روش های جدا سازی فیزیکی باکتری از محیط کشت بجای روش شیمیایی از یک سو آسیب­های احتمالی به ساختار سلولی باکتری را کاهش داده و از سوی دیگر با استفاده از فرمالین بجای تیومرسال زمان مورد نیاز برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه به حداقل تقلیل یافت تا ضمن کاهش دوره فرآوری   آنتی ژن بتوان فرآورده ای با کیفیت مناسب تر را تولید نمود (4).تعداد صفحه : 112قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید