دانلود پایان نامه ارشد : بررسی الگوی بیان ژن رمزکننده H+- ATPase غشای پلاسمایی

دانلود متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته کشاورزی 

گرایش : اصلاح نباتات

عنوان : بررسی الگوی بیان ژن رمزکننده H+- ATPase غشای پلاسمایی

دانشگاه شیراز 

دانشکده کشاورزی

پایان نامه کارشناسی ­ارشد در رشته اصلاح نباتات

 بررسی الگوی بیان ژن رمزکننده H+– ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش ­فلزات سنگین

 استاد راهنما

دکتر عباس عالم‏زاده

اساتید مشاور

دکتر هومن راضی

 دکتر حسن پاک‏نیت

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکیده

به منظور بررسی الگوی بیان ژن H+– ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش ­فلزات سنگین بذور این گیاه پس از جمع آوری از منطقه پل فسا واقع در جنوب شهر شیراز در گلخانه بخش زراعت و اصلاح نباتات داشکده کشاورزی دانشگاه شیراز کشت شدند. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. پس از گذشت دو ماه تیمار‏های سرب، جیوه، نقره و کلرید سدیم هر کدام در دو سطح اعمال شدند. سپس در چهار بازه زمانی 0، 6، 48 و 72 ساعت پس از تنش نمونه برداری انجام و سریعا نمونه‏ها در نیتروژن مایع قرار داده و سپس تا زمان انجام آزمایش در فریزر 80- نگهداری شدند. نتایج نشان داد که فلزات سنگین مختلف تأثیر متفاوتی روی رشد گیاه و میزان بیان ژن Alha1 دارند. بررسی بیان ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی نشان داد که در سطح µM50 بیشترین میزان بیان ژن مربوط به نقره زمان 72 ساعت و کمترین آن مربوط به سرب در زمان 6 ساعت پس از اعمال تنش بود. همچنین در سطح µM 100 بیشترین میزان بیان ژن مربوط به تیمار نقره در زمان 72 ساعت و کمترین آن مربوط به سرب در زمان 72 ساعت پس از اعمال تنش بود. همچنین بیان ژن تحت تأثیر کلرید سدیم در دو غلظت mM 200 و mM 400 در همه زمان‏ها افزایش یافت. همچنین مشاهده شد که مقدار فلزات در گیاه بدون تأثیر بر رشد گیاه افزایش یافت. این نتایج نشان می‏دهد که این گیاه ممکن است فلزات سنگین را بخوبی در خود نگه داشته و در این میان ژن Alha1 نقش مهمی بازی می‏کند. به طور کلی می‏توان گفت که میزان بیان ژن در گیاه تحت تأثیر نوع فلز، غلظت فلز، اندام مورد نظر، زمان تنش و شرایط تنش تغییر می‏کند.

فهرست مطالب

عنوان                 صفحه

فصل اول

مقدمه. 1

1-1- تنش…. 1

1-2- شوری خاک… 1

1-3- اثرات شوری بر گیاهان.. 2

1-4- تنش فلزات سنگین.. 2

1-4-1- سرب.. 4

1-4- 2- جیوه 4

1-4- 3- نقره 5

1-5- ویژگی‏های پروتئین‌های  H+-ATPaseغشای پلاسمایی.. 6

1-6- ویژگی‌های گیاه Aeluropus littoralis. 7

1-7- اهداف پژوهش…. 9

فصل دوم

مروری بر پژوهشهای پیشین.. 10

2-1- انتقال پیام در پاسخ به تنش فلزات سنگین.. 10

2-1- 1- سیستم کلسیم/کالمادولین.. 10

2-1-2- نقش هورمون‏ها 11

2-1-3- تنش اکسیداتیو. 11

2-1-4- مسیر MAPK.. 12

2-2- انواع پمپ‌های  ATPase. 12

2-3- H+-ATPase و تحمل تنش شوری.. 14

2-4- H+-ATPase و تحمل تنش فلزات سنگین.. 15

فصل سوم

مواد و روش‏ها 17

3-1- جمع آوری نمونه‌ها‌ی گیاهی.. 17

3-2- کاشت بذرها 17

3-3- اعمال تیمار. 18

3-4- محلول هوگلند. 19

3-5- اندازه‏گیری میزان عناصر. 20

3-6- طراحی آغازگر. 21

3-7- استخراج دی‏ان‏ا از نمونه‌ی‌ گیاهی با استفاده از روش CTAB تغییریافته‌. 22

3-7-1-تهیه‌ی محلول استخراج. 22

3-7-2- روش کار 22

3-7-3- محلول شستشوی شماره 1. 24

3-7-4- محلول شستشوی شماره 2. 24

3-8- استخراج آر‌ان‌ا 24

3-8-1- روش کار 24

3-9- سنتز رشته اول cDNA.. 26

3-10- واکنش  RT-PCRبرای ژن‏های  AlHA1و مرجع.. 26

3-11- تهیه ژل آگارز. 27

3-12- بافر( X50) TAE.. 28

3-12-1- محلول Tris 28

3-12-2- محلول اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) 28

3-13- همسانه‌سازی قطعه مورد نظر در پلاسمید. 29

3-13-1- اتصال قطعه مورد نظر به درون ناقل پلاسمیدی.. 29

3-13-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری E. coli سویه DH5α. 30

3-13-3- انتخاب همسانه‌ها 31

3-13-4- کشت شبانه‌ی کلنی‌های مثبت.. 32

3-13-5- استخراج پلاسمید نوترکیب از باکتری به روش لیز کردن آلکالاینی.. 32

3-13-6- هضم آنزیمی پلاسمیدهای نوترکیب.. 35

3-14- آنالیز‏های آماری.. 36

فصل چهارم

نتایج و بحث… 37

4-1- آنالیز صفات مورفولوژیک… 37

4-1-1- وزن ریشه. 37

4-1-2-وزن ساقه. 39

4-1-3- وزن کل گیاه 40

4-1-4-طول ریشه. 41

4-1-5- طول ساقه. 41

4-1-6-طول کل گیاه 42

4-2- اندازه‌گیری عناصر در گیاه. 43

4-2-1- جیوه 44

4-2-2- سرب.. 44

4-2-3- نقره 45

4-3- کمیت و کیفیت دی‌ان‌ا استخراج شده. 46

4-4- استخراج RNA از برگ گیاه A. littoralis. 46

4-5 – واکنش زنجیره‌ای پلیمراز PCR 47

4-6- بررسی بیان ژن Alha1 تحت تنش فلزات سنگین  و شوری به روش نیمه کمی.. 48

4-6-1- بررسی اثر سطوح مختلف سرب در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1  49

4-6-2- بررسی اثر سطوح مختلف نقره در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1  50

4-6-3- بررسی اثر سطوح مختلف کلرید سدیم در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1  52

4-6-4- بررسی اثر سطوح مختلف جیوه در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1  53

4-7- همسانه‌سازی محصول پی‏سی‏آر. 56

4-8 – نتیجه‏ گیری.. 57

4-9- پیشنهادات.. 58

مقدمه

1-1- تنش                                        

در محیط‏های طبیعی و شرایط زراعی، گیاهان به دفعات در معرض تنش‏های محیطی قرار می‏گیرند. تنش معمولاً به عنوان یک عامل خارجی که باعث تأثیر منفی بر زندگی گیاه می‏شود تعریف می‏شود. مفهوم واژه تنش همواره با تحمل تنش همراه است که قابلیت گیاه در رو به رو شدن با شرایط نامساعد محیطی است. تطابق و سازگاری به تنش‏های محیطی ناشی از تغییرات در سطوح مختلف اندام‏های موجود زنده از سطح آناتومیک و مورفولوژیک تا سطوح سلولی، بیوشیمیایی و مولکولی رخ می‏دهد. واکنش‏های سلولی به تنش شامل تغییر در چرخه سلولی و تقسیم سلولی، تغییر در سیستم غشاهای داخلی و واکوئلی سلول و تغییر در ساختار دیواره سلولی است که در تمام این پاسخ‏ها شاهد تغییر الگوی بیان ژن یا ژن‏هایی هستیم است که محصول آن‏ها در تنش مؤثر هستند (Taiz and Zeiger, 1991).

1 -2 – شوری خاک

سابقه شوری خاک به اندازه تمدن بشری است و احتمالاً دلیل انقراض تمدن باستانی سومر، شور شدن خاک بوده است (Jacobsen and Adams, 1958). امروزه نیز شوری یکی از تنش‏های غیر زنده مهم به شمار می‏رود که  اثرات زیانباری بر عملکرد و کیفیت محصول دارد (Boyer, 1982). در آسیا بیشترین مساحت اراضی شور پس از کشورهای آسیای میانه، هندوستان و پاکستان در ایران قرار دارد. از کل مساحت ایران که 165 میلیون هکتار است، حدود 44 میلیون هکتار آن تحت تاثیر شوری بوده که نزدیک به 30 درصد دشت‏ها و متجاوز از 50 درصد اراضی تحت کشت آبی کشور را تشکیل می‏دهد (Pillaya et al., 2005). منبع اصلی که خاک را شور می‏کند نمک‏های محلولی است که در منابع آب زیر زمینی وجود دارد. برآورد شده است که تقریباً 15 درصد از اراضی ایران تحت تأثیر نمک با درجات مختلف قرار دارد (ملکوتی و همکاران، 1381). شوری خاک و آب‏های کم کیفیت از جمله مشکلات جدی در تولید محصولات کشاورزی می‏باشند. ایران از جمله کشور‏هایی است که با کمبود آب آبیاری و مشکل خاک روبرو است. مشکل شوری به خاطر زیاد بودن تبخیر از سطح خاک، بارندگی کم، پستی و بلندی زمین‏ها، آبیاری با آب دارای کیفیت نامناسب و سنگ‏های نمکی است. عوامل فوق باعث به وجود آمدن شوره‏زار‏های زیادی شده است. در سال‏های اخیر روند شور شدن خاک‏ها افزایش یافته و هکتار‏ها زمین قابل کشت به علت تجمع بیش از حد نمک غیر قابل کشت شده‏اند (Pillaya et al., 2005).

1-3- اثرات شوری بر گیاهان

شوری برای رشد گیاه یک عامل محدود کننده است بدان سبب که باعث ایجاد محدودیت‏های تغذیه‏ای از طریق کاهش جذب فسفر، پتاسیم، نیترات و کلسیم و افزایش غلظت یونی درون سلولی و تنش اسمزی می‏شود (Guo et al., 2001). در اثر شوری، پتانسیل آب محیط می‌تواند از پتانسیل آب گیاه منفی‌تر شود و همین امر جذب آب توسط گیاه را با مشکل روبه‌رو می‌کند (کافی و مهدوی دامغانی، 1379). در شرایط وقوع شوری، یون‏هایی مثل Na+ و Cl، به داخل لایه‏های هیدراسیونی پروتئین‏ها نفوذ کرده، سبب اختلال در کار پروتئین‏ها می‏شوند. مسمومیت یونی، تنش اسمزی و کمبود مواد مغذی که در شرایط وقوع شوری رخ می‏دهد، سبب بهم خوردن توازن یونی و در پی آن تنش اکسیداتیو می‏شوند (Guo et al., 2001). کاهش رشد در گیاهان تحت شرایط تنش شوری می‏تواند به دلیل کاهش ذخایر انرژی گیاه باشد که این متأثر از کاهش و اختلال فعالیت‏های زیستی و متابولیسمی گیاه می‏باشد (Kerepesi and Galiba, 2000).  

1 – 4- تنش فلزات سنگین

فلزات سنگین گروهی از فلزات هستند که چگالی بالاتر از 5 گرم بر سانتیمتر مکعب دارند. فلزاتی مانند سرب، کادمیوم، کروم، جیوه، نقره و نیکل جزء این گروه هستند (Sanita et al., 1999). منابع اصلی فلزات سنگین معمولاً پساب‏های صنعتی حاصل از کارخانه‏ها، آب فلزکاری، احتراق سوخت‏های فسیلی، آفت کش‏ها و معادن می‏باشد. غلظت فلزات سنگین در خاک از ناحیه‏ای به ناحیه دیگر تفاوت دارد و ممکن است از حد مجاز تا10 تا 50 برابر حد مجاز باشد (Wagner, 1993؛ Hagg – Kerwer et al., 1999). خاک‏های واقع بر صخره‏های غنی از فلزات یا تپه‏های گدازه آتشفشانی به طور طبیعی دارای غلظتی از فلزات سنگین هستند که برای بیشتر گونه‏های گیاهی سمی می‏باشند.

گروهی از فلزات سنگین از جمله مس، روی، منگنز، آهن و نیکل از جمله ریز مغذی‏های ضروری برای انجام طیفی وسیعی از فرایند‏های فیزیولوژیک هستند. این ریز مغذی‏ها دارای نقش‏های ساختاری و تنظیمی زیادی در درون سلول هستند (Brett et al., 2005).

سرنوشت فلزات سنگین و ترکیبات فلزی که وارد خاک‏ها و آب‏ها می‏شوند با توجه به شرایط محیطی خاک و آب بسیار متفاوت می‏باشد .عوامل تأثیرگذار زیادی بر جذب فلزات مؤثر می‏باشند به طوری که به جز نوع و مقدار کلوئیدهای خاک، عوامل کنترل کننده‏ای نظیر pH، غلظت یونی محلول، غلظت کاتیونی فلز، حضور کاتیون‏های فلزی رقابت کننده و وجود لیگاندهای آلی و معدنی در آن نقش دارند (Alloway and Jackson, 1990).

هنگامی که فلزات سنگین درون بافت گیاهی تجمع می‏یابند اغلب به دو صورت باعث سمیت می‏شوند:

1- به صورت غیر مستقیم: از طریق قرار گیری به جای سایر عناصر غذایی ضروری در رنگدانه‏ها و یا آنزیم‏ها و اختلال در عملکرد آن‏ها (Kupper et al., 1999).

2- به صورت مستقیم با تخریب ساختار سلول: حضور فلزات سنگین باعث ایجاد تنش اکسیداتیو و افزایش تولید گونه‏های فعال اکسیژن[1] می‏شود (Chaoui and Ferjani, 2005؛ Mishra et al., 2006).

همچنین تنش فلزات سنگین همانند سایر تنش‏های غیر زیستی منجر به تغییر در مسیرهای سنتز متابولیت‏های ثانویه گیاهی شده و باعث افزایش یا کاهش این ترکیبات می‏شود (Tirilini et al., 2006؛ Santiago et al., 2000). سمیت فلزات سنگین ممکن است ناشی از اتصال آن به گروه‏های سولفیدریل پروتیین‏ها و پیش‏گیری از فعالیت یا تخریب ساختار پروتیین‏ها و یا ناشی از جایگزینی فلزات غیر ­ضروری به جای فلزات ضروری باشد (Hall, 2002).

به منظور حفظ غلظت فلزات ضروری در محدوده فیزیولوژیک و به حداقل رساندن اثرات مخرب فلزات غیر­ضروری، گیاهان همانند دیگر موجودات، دارای شبکه پیچیده­ای از سازوکارهای هموستازیس به منظور کنترل جذب، تجمع، حمل و نقل و سم زدایی فلزات هستند (Schutzenduble and Polle, 2002). سلول­ها از ترکیبی از فرایند­های حجره­بندی، کلاته کردن و انتقال فلزات به منظور محدود کردن اثرات نا­خواسته فلزات و اطمینان از تحویل آن‏ها به پروتیین­های هدف استفاده می‏کنند. در این میان پروتیین­های ناقل تخصص یافته­ای در اشکال کانال، ناقل و یا پمپ، جابجایی فلزات سنگین از میان غشاها را بر عهده دارند (Dixit et al., 2001).

1-4-1- سرب

عنصر سرب با عدد اتمی 82 و وزن اتمی g 19/207 و چگالیg/cm3 34/11 یکی از
 مهمترین آلودگی‏های زیست محیطی در بسیاری  از جوامع است که باعث بروز خطرات جدی برای انسان و محیط زیست می‏شود (Garbisu and Alkorta, 2001). مقدار سرب در خاک‏های معمولی به طور متوسط mg/kg 15 گزارش شده در حالی که این مقدار در خاک‏های آلوده به سرب بیش از mg/kg 100 می‏رسد (Hutzinger, 1980). ورود مقدار بسیار کم سرب در گیاه می‏تواند اثرات منفی زیادی بر فرایند‏های فیزیولوژیک گیاه داشته باشد. سمیت سرب منجر به توقف فعالیت‏های آنزیمی، اختلال در تغذیه معدنی، عدم توان آبی گیاه، تغییر نفوذ پذیری غشا و تغییر هورمونی می‏شود (Malkovski et al., 2002). همچنین در اثر ورود سرب به گیاه، با بسته شدن روزنه‏ها شاهد کاهش فتوسنتز خواهیم بود (Ewais, 1997). تولید گونه‏های فعال اکسیژن در اثر تنش فلز سرب به عواملی چون شدت تنش، گونه، سن گیاه و طول مدت تنش بستگی دارد (Yadav, 2010).

تعداد صفحه :90

قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید