دانلود پایان نامه ارشد : تولید آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 Neospora caninum و استفاده از آن در تدوین روش لاتکس آگلوتیناسیون LAT

دانلود متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته دامپزشکی

گرایش : انگل شناسی

عنوان : تولید آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 Neospora caninum  و استفاده از آن در تدوین روش  لاتکس آگلوتیناسیون LAT

دانشگاه شیراز 

دانشکده دامپزشکی

 پایان نامه­ی‌ دکتری تخصصی در رشته‌ی دامپزشکی- انگل شناسی

 تولید آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 Neospora caninum  و استفاده از آن در تدوین روش  لاتکس آگلوتیناسیون LAT) ) و مقایسه ارزش تشخیصی آن با کیت تجاری الایزا

استادان راهنما

دکتر نسرین مقدر

دکتر ارسلان حسینی

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)چکیده نئوسپورا کانینوم، تک یاخته ای از شاخه آپی کمپلکسا، به عنوان عامل اصلی سقط در گاو شناخته شده است. آنتی ژن سطحی نئوسپورا کانینوم NcSAG1)) یک آنتی ژن ایمنودومینانت مهم برای تشخیص نئوسپوروزیس می باشد. هدف از تحقیق حاضر تولید آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 و استفاده از آن در تدوین روش لاتکس آگلوتیناسیون LAT) ) و مقایسه ارزش تشخیصی آن با کیت تجاری الایزا است. ژن نوترکیب NcSAG1 در پلاسمید pET-28a کلون شد و پروتئین در E. coli BL21 بیان شد. ذرات لاتکس کربوکسیله با آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 پوشانده شد و درجه تطابق بین دو تست LAT و کیت تجاری الایزا(iscomELISA) بر روی 164 نمونه سرم گاو که از 32 گله حومه شیراز جمع آوری گردید محاسبه شد. 22 (%13/4) و 23 (% 14 ) نمونه از سرم ها به ترتیب با تست LAT و الایزا حاوی آنتی بادی ضد نئوسپورا کانینوم بودند. در این روش تدوین شدحساسیت و اختصاصیت نسبی به ترتیب 81.8 و 96.4 درصد بود. 18 نمونه از 23 نمونه سرمی که با تست الایزا مثبت بودند با تست LAT نیز مثبت شدند و درجه تطابق قابل توجهی (κ = 0.77) بین نتایج دو تست به دست آمد. نتایج نشان داد که LAT براساس آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 تستی سریع، ساده و به نسبت کم هزینه است و برای تشخیص آنتی بادی های اختصاصی در آلودگی به نئوسپورا کانینوم تحت شرایط مزرعه مناسب به نظر می رسد. البته به تحقیقات گسترده تری نیاز است تا با تدوین روشهای بهتری برای خالص سازی آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 بتوان واکنشهای مثبت کاذب احتمالی را کاهش داد و در نتیجه درجه تطابق بین دو تست افزایش یابد. فهرست مطالبعنوان                                                                                                                      صفحه فصل اول: مقدمه........................................................................................................... 2فصل دوم: کلیات1-2- تاریخچه....................................................................................................................... 72-2- طبقه بندی انگل............................................................................................................................ 83-2- سیر تکاملی و ساختمان انگل ................................................................................................... 84-2- آنتی ژن‌های انگل........................................................................................................................ 111-4-2- آنتی ژنهای سطحی (Surface Antigens)............................................................... 132-4-2-  آنتی ژن های گرانول های متراکم............................................................................ 145- 2- تفریق نئوسپورا کانینوم از سایر گونه‌های انگلی................................................................ 161-5- 2- هاموندیا هیدورنی (H. heydorni)............................................................................. 162-5- 2-  نئوسپورا هوگشی (N. hughesi).............................................................................. 173-5- 2--توکسوپلاسما گندئی..................................................................................................... 176- 2- انتقال ................................................................................................................... 181-6- 2- انتقال عمودی.................................................................................................................. 182-6- 2-انتقال افقی......................................................................................................................... 193-6- 2- انتقال از راه شیر............................................................................................................. 204-6- 2- انتقال از راه جفتگیری.................................................................................................. 207- 2- نشانه های بالینی....................................................................................................................... 211- 7- 2- گاو ................................................................................................................................... 212- 7- 2- گوسفند........................................................................................................................... 223- 7- 2- اسب................................................................................................................................. 234-7- 2- بز......................................................................................................................................... 23عنوان                                                                                                                      صفحه 5-7- 2- سگ................................................................................................................................... 236- 7- 2- گربه.................................................................................................................................. 247- 7- 2- انسان................................................................................................................................ 248- 2- بیماریزایی.......................................................................................................................... 251- 8- 2- مکانیسم سقط جنین ................................................................................................. 262-8- 2-  آسیب های وارده به جفت  ...................................................................................... 273- 8- 2- آسیب های وارده به جنین........................................................................................ 279-2 - یافته‌های کالبدگشایی............................................................................................................... 3110-2-خسارات اقتصادی نئوسپوروزیس در گاو............................................................................. 3111-2- عوامل مستعد کننده............................................................................................................... 331-11-2-  حضور سگ ها.............................................................................................................. 332-11-2-  سایر گوشتخواران........................................................................................................ 333-11-2-  میزبان‌های واسط به غیر از گاو............................................................................... 334- 11-2- چراگاه، علوفه و آب شرب........................................................................................ 345-11-2- سن گله........................................................................................................................... 346-11-2- خوردن شیر یا آغوز...................................................................................................... 347- 11-2- سرکوب ایمنی ............................................................................................................ 348- 11-2- تراکم گله و ابعاد مزرعه............................................................................................ 359-11-2- آب و هوا......................................................................................................................... 3510- 11-2- تراکم جمعیت انسانی............................................................................................. 3511-11-2- فصل و نژاد................................................................................................................... 3512-11-2- پرورش.......................................................................................................................... 3512-2- ایمنی........................................................................................................................................... 3613-2- تشخیص...................................................................................................................................... 371- 13-2- روش‌های سرولوژیک.................................................................................................. 381- 1- 13-2- روش ایمونو فلورسنت آنتی بادی غیر مستقیم   (IFAT)................ 402- 1- 13-2- روش آگلوتیناسیون مستقیم  (DAT) ................................................... 413- 1- 13-2- روش الایزا ..................................................................................................... 424-1- 13-2- تست لاتکس آگلوتیناسیون (LAT).......................................................... 422- 13-2 - روش های تشخیص بافتی...................................................................................... 46عنوان                                                                                                                      صفحه 1-2-13-2 -  هیستوپاتولوژی................................................................................................ 462-2-13-2 -  هیستوشیمی................................................................................................... 473-2- 13-2 – ایمنوهیستوشیمی........................................................................................ 473-13-2 -  تکنیک‌های مولکولی........................................................................................... 484- 13-2 - استفاده از  مدل های حیوانی.......................................................................... 485-13-2 -  روش کشت سلول............................................................................................... 496-13-2 - تشخیص تفریقی.................................................................................................... 5014-2 – درمان......................................................................................................................................... 5015-2 - پیشگیری و کنترل........................................................................................... 5116-2 - پروتئین های نوترکیب و اهمیت آنها.................................................................................. 521-16-2 - سیستم های بیان ژن برای تولید پروتئین های نو ترکیب................................. 532-1-16-2 - سیستم های باکتریایی.......................................................................................... 543-1-16-2- سیستمpET............................................................................................................... 544-1-16-2 -  سیستم مخمری و قارچی ................................................................................. 545-1-16-2 - حشرات .................................................................................................................... 556-1-16-2  - سلول پستانداران .................................................................................................. 55فصل سوم: مواد و روش کار1-3- طراحی پرایمرها........................................................................................................................... 582- 3- تهیه تاکی‌زوئیت نئوسپورا کانینوم........................................................................................ 583- 3- استخراج DNA از تاکی‌زوئیتهای نئوسپورا کانینوم خالص شده.................................. 59۴- ۳- تکثیر قسمتی از ژن NcSAG1 با روش PCR.................................................................. 605- ۳- خالص سازی باند مورد نظر از ژل آگاروز ........................................................................... 616- ۳- اتصال Ligation) ) محصول PCR در پلاسمید pTZ57R ............................................ 627-3- تهیه ی سلول های پذیرا Competent cells)) از باکتری  E.coli GM2163 ........... 62٨-٣- وارد کردن پلاسمید به درون سلول باکتری ( (Transformation.................................. 639-3- تأیید وجود پلاسمید حاوی قطعه ی ژن مورد نظر درون کولونی باکتری ................. 63۱۰- ۳- تعیین توالی پلاسمیدهای بدست آمده (Sequencing).............................................. 64۱۱- ۳- برش قطعات حاوی NcSAG1 و پلاسمید  pET-28a................................................ 66۱-۱۱- ۳- برش NcSAG1 و پلاسمید  pET-28a با آنزیم های NcoІ  و ІІІ Hind................................................................................................ 67عنوان                                                                                                                      صفحه 12- ۳- اتصال قطعات برش خورده ی NcSAG1 و پلاسمید  pET-28a(Ligation)........ 67 -۱۳ ۳- تأئید وجود قطعه هدف NcSAG1)) درون پلاسمید  pET-28a............................ 67-۱۴ ۳- انتقال وکتورحاوی ژن موردنظر به داخل باکتری E.coli BL21 ............................... 68-۱۵ ۳- بررسی چند کولونی رشد کرده برای ارزیابی وجود ژن کلون شده........................... 68-۱۶ ۳- جداسازی پلاسمید SAG1-pET28 ................................................................................. 69-۱۷ ۳- برش پلاسمید با آنزیمهای NcoІ و HindІІІ  و الکتروفورز محصول برای اطمینان از وجود قطعه مورد نظر در پلاسمید  ................................................................. 69-۱۸ ۳- انتخاب یک یا دو کلون برای توالی یابی (برای حصول اطمیناناز توالی درست ژن)................................................................................................................ 69-۱۹ ۳- پس از حصول اطمینان از توالی ژن، کلون مورد نظر برای بیان ژنمورد استفاده قرار می گیرد.................................................................................................. 69۲۰-۳- خالص سازی (Purification) پروتئین های تولیدشده به فرم گنجیدگی های درون سلولی(Inclusion body) تحت شرایط دناتوره کننده..................................................... 70۲۱-۳- حل کردن (Solubilization)و بازتاخوردگی ( Refolding) پروتئین هایتولیدشده به فرم گنجیدگی های درون سلولی (Inclusion body).......................................... 71۲۲- ۳- اندازه گیری غلظت پروتئین نوترکیب  NcSAG1به روش لوری.............................. 73۲۳-۳- ارزیابی پروتئین نوترکیب خالص شده و بازتاخورده با استفاده ازSDS-PAGE  و وسترن بلاتینگ(Western Blotting)............................................................... 74۲۴- ۳- آزمایش وسترن بلاتینگ پروتئین ها................................................................................. 751-24- ۳-  بلاتینگ ....................................................................................................................... 752-24-3- مسدود سازی سطح کاغذ (Blocking).................................................................. 753-24- ۳- اضافه کردن سرم ضد نئوسپورا............................................................................... 764-24- ۳- اضافه کردن آنتی بادی کنژوگه............................................................................... 765-24- ۳- اضافه کردن محلول سوبسترا.................................................................................... 76۲۵- ۳- پوشاندن (Coating) ذرات لاتکس با آنتی ژن نوترکیب NcSAG1......................... 77۲۶- ۳- جمع آوری نمونه های سرم................................................................................................. 78۲۷-۳- انجام تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT) )....................................................................... 78۲۸-۳- انجام تست الایزا....................................................................................................................... 79۲۹-۳- مقایسه ارزش تشخیصی تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT) ) بر اساس آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 با تست الایزا ................................................................ 79عنوان                                                                                                                      صفحه فصل چهارم: نتایج۱-۴- تکثیر قسمتی از ژن NcSAG1 با روش PCR................................................................... 81۲-۴- کلون کردن ژن NcSAG1 در پلاسمید pTZ57R/T....................................................... 82۳-۴- استخراج پلاسمید از کلون 2163 E.coli GM حاوی قطعه ژنی مورد نظردر پلاسمید pTZ57R/T........................................................................................................................ 83۴-۴- برش پلاسمید حاوی قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a  (کلون 2821)با آنزیم ІІІ Hind .................................................................................................................................. 84۵-۴- برش قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a  بریده شده با آنزیم ІІІ Hind، بوسیله آنزیم NcoІ.............................................................................................................................................. 85۶-۴- خالص سازی قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a  بریده شده با آنزیم های ІІІ Hind و NcoІ.................................................................................................................................. 86۷-۴- کلون کردن قطعه ژنی NcSAG1 بریده شده در پلاسمید pET-28a بریده شده با همان آنزیم ها............................................................................................................... 87۸-۴- نتایج بیان پروتئین نوترکیب.................................................................................................... 88۹-۴- نتایج خالص سازی پروتئین نوترکیب تولیدشده به فرم گنجیدگی های درون سلولی.............................................................................................................. 91۱۰-۴- نتایج اندازه گیری غلظت پروتئین نوترکیب NcSAG1 به روش لوری.................... 93۱۱-۴- نتایج حاصل از وسترن بلاتینگ پروتئین نوترکیب خالص شده تحت شرایط دناتوره کننده.................................................................................................................. 94۱۲-۴- نتایج حاصل از الکتروفورز و وسترن بلاتینگ پروتئین نوترکیب بازتاخورده............ 95۱۳-۴- نتایج حاصل از تست لاتکس آگلوتیناسیون...................................................................... 95فصل پنجم: بحثپیشنهادات...................................................................................................................... 103فهرست منابع و مآخذ............................................................................................ 104مقدمه  نئوسپورا کانینوم تک یاخته اجباری داخل سلولی از شاخه آپی کمپلکسا ، اولین بار توسط برکاس و همکارانش (۱٩۸۴) توصیف شد. دوبی و همکاران (۱٩۸۸) این تک یاخته را برای اولین بار از سگ ها جدا و نامگذاری کردند (Dubey et al. 1988a,b) سپس مشخص شد که میزبان نهائی نئوسپورا کانینوم، سگ است (Holmdahl and Mattsson 1996; Lindsay et al. 1995  Basso et al. 2001;).نئوسپورورزیس از علل اصلی سقط جنین گاو است، از این رو با سقط ‌، مرده زائی، تولدگوساله ضعیف یا همراه با عفونت دائمی و کاهش تولید شیر ضررهای اقتصادی قابل توجهی ایجاد می کند. انتشار عفونت در گاو با انتقال تاکی زوئیت از مادر به جنین و یا با خوردن آب و غذائی آلوده به اووسیست انگل صورت می گیرد 1999, Trees et al. 1999; Romero et al. 2004) Dubey).مطالعات انجام شده در برخی کشورها حاکی از این است که ۴۲-۱۳ درصد جنین های سقط شده در گاوها به این انگل آلوده هستند (Dubey and Lindsay 1993; Dubey et al. 2006 ). نئوسپورا کانینوم علاوه بر گاو ، سایر گونه های اهلی چون اسب، گوسفند، بز، شتر، سگ، گربه و سگ سانان وحشی را آلوده می کند (Dubey 2003; Gondinm 2006 ).نئوسپوروزیس انتشار جهانی داشته و از بسیاری از کشورهای جهان گزارش شده است، ایران نیز از این قائده مستثنی نیست. در بررسی آلودگی نئوسپورا کانینوم در گاوهای شیری سقط کرده، رزمی و همکاران (۲۰۰۶) اولین مورد سقط جنین گاوی را در مشهد گزارش کردند و ۱۸/۱۵درصد نمونه های سرمی گاوها در تست  IFAمثبت بودند(et al. 2007; Sadrebazzaz et al. 2004  Razmi).با توجه به گزارشاتی مبنی بر وجود آلودگی در گاوهای کشور و خسارات اقتصادی حاصله بر صنعت گاوداری، طراحی و ارزیابی تستهای تشخیصی حساس و اختصاصی که توانایی تشخیص حیوانات آلوده را به منظور کنترل نئوسپورا کانینوم در سطح گله داشته باشند ضروری به نظر می رسد.از زمان شناسایی نئوسپورا کانینوم تاکنون روشهای تشخیصی زیادی برای شناسایی آلودگی دامها به این انگل ابداع شده است. از این میان می توان به روشهای هیستوپاتولوژی، ایمونوهیستوشیمی، سرولوژی، مولکولی، کشت سلولی و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی اشاره نمو د(2003 Dubey and Schares 2006 ; Dubey and Lindsay 1993; Dubey et al. 2006; Dubey )تشخیص قطعی بر اساس آزمایش ایمونوهیستوشیمی بافتهای آلوده است. این روش معمولاﹰ برای تأیید سایر روشها و نیز برای تفکیک نئوسپورا کانینوم از توکسوپلاسما گندئی استفاده شده اما روشی وقت گیر بوده و تفسیر نتایج آن مشکل است (Dubey and Lindsay 1993; Jones 1996; Romand et al. 1998; Dubey and ;Schares 2006; Dubey 2003).تشخیص آلودگی عمدتا با روشهای سرولوژیکی، به عنوان ابزار مهمی برای بررسی های کلینیکی و اپیدمیولوژیکی، انجام می شود (et al. 2007 Silva).آزمایشات سرولوژیک دارای این مزیت هستند که قبل از مرگ دام قابل انجام بوده و اطلاعات کافی در مورد مرحله آلودگی فراهم می سازند (Dubey and Schares 2006). از آنجایی که تنها نشانه در معرض قرار گرفتن با نئوسپورا کانینوم، حضور آنتی بادی های اختصاصی در سرم گاو است، روشهای مختلف سرولوژیک برای تشخیص آنتی بادی به کار گرفته شده که شامل  IFAT، انواع الایزا وDAT هستند (et al. 1997 Williams  Romand et al. 1998;  Packham et al. 1998; Paré et al. 1995a;  Lally et al. 1996;  Conrad et al. 1993a;   Björkman and Lunden 1998; ). در این روشها از تاکی زوئیت کامل یا آنتی ژن های مشتق شده از تاکی زوئیت استفاده می شود که به علت واکنش متقاطع با سایر انگلهای مربوطه مانند توکسوپلاسما گندئی باعث واکنش مثبت کاذب می شود(et al. 1993b; Dubey and Lindsay 1993 Conrad et al. 2003; ; 1999 Chahan Bjorkman and Uggla ). همچنین به علت نیاز این آزمایشات به استفاده از مقادیر زیاد آنتی ژنهای مشتق شده از کشت سلولی، اغلب تهیه آنتی ژن و استاندارد کردن آن مشکل است و به دلیل تفاوت در میزان بقایای سلول میزبان بر اختصاصیت و تکرارپذیری نتایج تست تاثیر می گذارد (Lally et al. 1996;  Jiang et al. 2008;  al. 1996;   et Baszler). بنابراین ضروری است که تست تشخیصی مطمئن، حساس و اختصاصی با استفاده از آنتی ژن های اختصاصی نئوسپورا کانینوم طراحی شود.آنتی ژن های نوترکیب درمقایسه با آنتی ژن های کامل، مزایای بیشتری دارند زیرا اولا به آسانی درحجم زیاد تهیه می شوند و ثانیا به راحتی برای آزمایشات تشخیصی استاندارد می شوند. بنابراین با به کارگیری این آنتی ژن ها، نیازی به آنتی ژن های مشتق شده از کشت سلولی نیست (et al. 2003; Louie et al. 1997  Chahan).تاکنون چندین آنتی ژن نئوسپورا کانینوم شناسایی شده اند که اغلب آنها شامل پروتئین هایی هستند که روی سطح مراحل مهاجم انگل ظاهر می شوند مانند  NcSAG1و  NcSRS2که از آنتی ژن های سطحی ایمونودومینانت اصلی هستند (immunodominant surface antigens  major). علاوه بر این ، آنتی ژن هایی نیز هستند که بطور موقتی روی سطح تاکی زوئیت های انگل ظاهر می شوند مانند محتویات میکرونم، راپتری و گرانولهای متراکم. این ها ارگانل های ترشحی در ناحیه قدامی مراحل مهاجم انگل هستند و در واکنشهای فیزیکی مستقیم بین انگل و سلول میزبان نقش دارند ( Soldati et al. 2001; Sonda et al. 2000et al. 1998; Nishikawa et al. 2001a;b;  Liddell Lally et al. 1997;  Boothroyd 2000; Dubremetz et al. 1998; Hemphill et 1997 Black and ).  اگرچه NcSAG1 و  NcSRS2 بطور واضح با همتاهای خود در توکسوپلاسما گندئی (TgSAG1 و TgSRS2) هومولوگ هستند اما میزان تشابه توالی به اندازه ای نیست که باعث بروز واکنش متقاطع شود، از این رو به عنوان مارکرهای تشخیصی عالی برای تمایز موثر بین نئوسپورا کانینوم و توکسوپلاسما گندئی قابل استفاده هستند (Howe et al. 1998). همچنین پاسخهای ایمنی القاء شده توسط این آنتی ژن های سطحی، آنها را به مارکرهای ایده آل برای تشخیص سرولوژیکی آلودگی به نئوسپورا کانینوم و تهیه واکسن تبدیل کرده استChahan et al. 2003; Gaturaga et al. 2005; Howe et al. 1998; Liu et al. 2007; Pinitkiatisakul et al. 2005 ) Ahn et al. 2003; ).تست الایزا با استفاده از آنتی ژن های tNcSRS2 -GST و GST-NcSAG1t برای تشخیص نئوسپورا کانینوم طراحی و مورد استفاده قرار گرفته است و نتایج نشان می دهد که این تست، حساسیت و اختصاصیت بالایی دارد و واکنش متقاطعی با سرم مثبت  توکسوپلاسما گندئی ندارد Liu et al. 2007 ; Pinitkiatisakul et al. 2005; Hemphill et al. 1997; l Gaturaga et al. 2005;  Ahn et al. 2003; ).اکثر تستهای تشخیصی به صورت کیت های تجاری وارداتی، پرهزینه و وقت گیرهستند و به مواد و ابزارخاصی نیز نیاز دارند که آن ها را برای کاربرد فیلدی و کلینیکی نامناسب می سازند (et al. 2005  Chahan et al. 2003; Liao )، از این رو طراحی و ارزیابی تست تشخیصی با حساسیت و اختصاصیت بالا که به ابزار اختصاصی پیشرفته نیاز نداشته باشد و در عین حال سریع و آسان انجام شود ضروری است. تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT)) یکی از راحت ترین تستهای تشخیصی است و در حال حاضر به عنوان یک تست تجاری در دسترس برای تشخیص توکسوپلاسما گندئی استفاده می شود ( et al. 2004  Huang). در تحقیقی از تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT)) با  آنتی ژن نوترکیب TgMIC3 برای تشخیص سرولوژیکی توکسوپلاسما گندئی استفاده شده که به علت اختصاصیت بالا ، کاربرد سریع و ساده،کم هزینه بودن و مناسب  برای استاندارد شدن، روش تشخیصی مناسبی گزارش شده است (Jiang et al. 2008). تاکنون از این تست برای تشخیص نئوسپورا کانینوم استفاده نشده ولی از آنجایی که TgMIC3 هومولوگ NcMIC3 است و با سرم گاو آلوده به نئوسپورا کانینوم واکنش متقاطع می دهد ) Jiang et al. 2008)، در تحقیق حاضر از NcSAG1 نوترکیب به عنوان آنتی ژن برای تشخیص آنتی بادی ضد نئوسپورا کانینوم در گاو استفاده شد (2005 et al.  Chahan et al. 2003; Liao).هدف از این تحقیق طراحی و استاندارد کردن تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT)) بر اساس آنتی ژن نوترکیب   NcSAG1 برای تشخیص سرولوژیکی نئوسپورا کانینوم و مقایسه ی ارزش تشخیصی این تست با کیت تجاری الایزا است.کلیات1-2- تاریخچه نئوسپورا کانینوم (Neospora caninum)  تک یاخته داخل سلولی اجباری از شاخه آپی کمپلکسا (Apicomplexa) و بسیار شبیه توکسوپلاسما گندئی (Toxoplasma gondii) است. در ابتدا در سگ های نروژی دارای علائم عصبی مانند آنسفالیت و فلجی اندام های حرکتی انگلی شبیه به توکسوپلاسما گندئی گزارش شد (Bjerkas et al. 1984). سپس انگل در سال 1987 در گوساله های مبتلا به میلوآنسفالیت مشاهده گردید ( Anderson et al. 2000).در یک مطالعه گذشته نگر مقاطع آسیب شناسی، نشانه های بالینی و اطلاعات آزمایشگاهی ثبت شده از 23 سگ نروژی که در آنها یک بیماری مانند توکسوپلاسموزیس تشخیص داده شده بود را مورد بررسی و با میکروسکوپ نوری و الکترونی مورد مطالعه قرار دادند. در 13 مورد عامل بیماری توکسوپلاسما گندئی تشخیص داده شد، اما در 10 مورد دیگر از سگ ها یک جنس جدید به نام نئوسپورا و گونه ای به نام نئوسپورا کانینوم که از نظر ساختمانی و آنتی ژنی متفاوت از توکسوپلاسما گندئی بود، تشخیص داده شد. به این دلیل این انگل نئوسپورا نام گرفت که از لحاظ سیر تکاملی و ریخت شناسی مشابه با سایر اعضای دسته اسپوروزوآ (Sporozoea) بود و چون برای اولین بار تشخیص داده می شد انگل هاگ دار جدید یا نئوسپورا نام گرفت (2003b; Dubey et al. 1988 Dubey).تا مدت ها سیر تکاملی این انگل کاملاً روشن نبود و میزبان نهایی آن شناسایی نشده بود و تنها حدس زده می شد که به دلیل شباهت هایی که با خانواده سارکوسیستیده (Sarcocystidae) دارد باید میزبان نهایی آن یک گوشتخوار باشد. محققین تعداد زیادی از حیوانات و پرندگان را با مرحله کیستی انگل به طور تجربی آلوده کردند، اما نتوانستند اووسیست های انگل را به دست بیاورند و همچنان میزبان نهایی ناشناخته بود تا در یک بررسی اووسیست های انگل از دو قلاده سگ که به طور طبیعی آلوده شده بودند، جدا شد و سگ به عنوان میزبان نهایی انگل معرفی شد. مدتی بعد نیز اووسیست های این انگل را از مدفوع چند قلاده کایوت جدا کردند و کایوت نیز به عنوان میزبان نهایی انگل مطرح شد  (Dubey 1992; Haddad et al. 2005 ).از سال 1984 تا کنون شاهد پیشرفت های فراوانی در زمینه یافته های جدید نئوسپورا بوده ایم، به طوری که تا کنون مقالات زیادی در زمینه های مختلف نئوسپوروزیس از نقاط مختلف جهان منتشر شده است. در ایران نیز اولین بار سقط ناشی از نئوسپورا کانینوم در مشهد توسط رزمی و همکاران (2007) گزارش شد (Razmi et al. 2007 Dubey1999 b; ).2-2- طبقه بندی انگلتک یاخته نئوسپورا کانینوم در شاخه آپی کمپلکسا، رده اسپوروزوا، راسته اوکوکسیدیدا (Eucoccidiidae) ، خانواده سارکوسیستیده، تحت خانواده توکسوپلاسماتینه (Toxoplasmatinae) و جنس نئوسپورا قرار دارد (1999 Hemphill).3-2- سیر تکاملی و ساختمان انگل نئوسپورا کانینوم انگل دو میزبانه اجباری است (شکل 1-2). سگ و کایوت تنها میزبان های نهایی شناخته شده برای نئوسپورا کانینوم هستند. سگ ها می توانند هم میزبان واسط و هم میزبان نهایی انگل باشند. سیر تکاملی انگل به سه مرحله تاکی زوئیت، برادی زوئیت و اووسیست تقسیم می شود (et al. 2006 Dubey 2003b; Dubey  ).اووسیست‌های انگل به همراه مدفوع میزبان نهایی به بیرون منتشر و در محیط تحت شرایط مناسب (اکسیژن، رطوبت و درجه حرارت) در عرض سه روز هاگ دار می‌شوند. داخل هر اووسیست، دو اسپوروسیست و داخل هر اسپوروسیست، چهار اسپوروزوئیت تشکیل می شود. ابعاد اووسیست‌های هاگ دار حدود 7/11×3/11 میکرون و اسپوروزوئیت‌ها 5/6×2 میکرون است. این اووسیست‌ها شبیه به اووسیست‌های توکسوپلاسما گندئی و هاموندیا هاموندی (Hammondia hammondi) در مدفوع گربه و هاموندیا هیدورنی (Hammondia heydorni) در مدفوع سگ هستند که جهت تفریق آنها از یکدیگر استفاده از روش‌های ژنتیکی الزامی است (Dubey and Schares 2006 Dubey 2003b;  ).اووسیست‌های هاگ دار انگل همراه با آب و مواد غذایی توسط میزبان‌های واسط خورده می‌شوند. اووسیست‌ها در روده، پاره و اسپوروزوئیت‌ها آزاد شده و پس از ورود به سلول های پوششی روده به تاکی زوئیت تبدیل می‌شوند. تاکی زوئیت‌های هلالی شکل به ابعاد 6×2 میکرون هستند و به سرعت از طریق آندودیوژنی تکثیر می یابند. تاکی زوئیت‌ها، سلول های عصبی، آندوتلیال عروق، سلول های کبدی، ماکروفاژها، فیبروبلاست‌ها، میوکارد و نیز تروفوبلاست‌های جفتی را در حیوانات آبستن مورد تهاجم قرار می‌دهند. همچنین مرحله تاکی زوئیت‌ ممکن است از طریق جفت در حیوانات آبستن به جنین منتقل شود (Dubey and Lindsay 1993  et al. 2006; Dubey Barr et al. 1993;  ).سیستم ایمنی میزبان مدتی پس از آلوده شدن میزبان واسط بر علیه تاکی زوئیت‌ها که دارای رشد و تکثیر سریع هستند، تحریک و باعث حذف آنها از بافت‌ها می شود. این مرحله توسط برادی زوئیت‌های 8-7×2 میکرونی که دارای رشد کندی بوده و در داخل سلول های میزبان، درون کیست‌ها هستند، جایگزین می‌شود. کیست‌های نئوسپورا کانینوم گرد تا بیضی شکل و بیشتر در سلول های عصبی و شبکیه چشم یافت می‌شوند. اندازه کیست های بافتی ممکن است بسته به تعداد برادی زوئیت های داخل آن ها، بسیار متفاوت باشد. کیست های بافتی در سگ ها حدود 107 میکرون قطر دارند و ضخامت دیواره آنها تا 4 میکرون می رسد. کیست های بافتی در جنین گاو و گوساله هایی که به صورت مادرزادی مبتلا هستند در مغز و طناب نخاعی یافت می شوند. این کیست ها کمی بیش از 50 میکرون قطر دارند و ضخامت دیواره آنها کمتر از 5/2 میکرون است. تعداد کمی از کیست های بافتی با دیواره نازک (1- 3/0 میکرون) در عضلات اسکلتی گاو و سگ هایی که به صورت طبیعی با انگلی شبیه نئوسپورا کانینوم آلوده بودند، گزارش شده است. چنین کیست های بافتی هنوز در حیواناتی که به صورت تجربی آلوده می شوند دیده نشده است. برادی زوئیت‌ها درون کیست‌ها از پاسخ سیستم ایمنی میزبان در امان می‌مانند و به حالت نهفته زندگی می‌کنند، در نتیجه هیچ گونه واکنش ایمنی ایجاد نمی‌کنند. زمانی که سیستم ایمنی به هر علتی تضعیف شود دوباره به تاکی زوئیت تبدیل می‌شوند (et al. 2006 Dubey 2003b;  Dubey ).برادی زوئیت ها واجد یک هسته انتهایی و تعداد کمی گرانول آمیلوپکتین هستند که در رنگ آمیزی پریودیک اسید شیف ,(PAS) رنگ قرمز می گیرند. همچنین برادی زوئیت ها را می توان به صورت اختصاصی توسط آنتی بادی اختصاصی برادی زوئیت (BAG-1) از تاکی زوئیت ها تفریق کرد. عمدتاً اعتقاد بر این است که انگل به صورت مرحله برادی زوئیت (کیست های بافتی) در بافت های گاوهای بالغ باقی می ماند. با وجود این، کیست های بافتی تا کنون در مقاطع بافت شناسی از گاوهای بالغی که به صورت طبیعی مبتلا شده اند مشاهده نشده است (et al. 2006 Dubey).تاکی زوئیت‌های موجود در جفت و کیست‌های موجود در بافت های میزبان واسط منبع مهم آلودگی برای سگ‌ها هستند. سگ‌ها 7 تا 15 روز پس از خوردن بافت‌های آلوده میزبان‌های واسط، اووسیست‌های انگل را با مدفوع خود دفع می‌کنند (شکل 2-2). مدت زمان دفع اووسیست‌ها توسط سگ و تناوب آنها به درستی مشخص نیست، هر چند گزارش شده که سگ ها بیشتر از یک نوبت، اووسیست را دفع می کنند (Mcgarry et al. 2003  2003 b;  Dubey).
 
شکل 1-2: سیر تکاملی نئوسپورا کانینوم (19)
در رابطه با توان بقای اووسیست‌ها در طبیعت نیز اطلاعات زیادی در دسترس نیست. مراحل شیزوگونی و گامتوگونی که به نظر می رسد آغازگر تشکیل اووسیست ها در روده سگ هستند تا کنون مشاهده نشده اند. هر چند مراحلی شبیه شیزونت در کشت های سلولی کشت شده با برادی زوئیت های جدا شده از مغز سگ هایی که به صورت طبیعی مبتلا بودند، گزارش شده اند. مطالعات سرواپیدمیولوژیک به اهمیت نقش سگ ها در سیر تکاملی نئوسپورا کانینوم اشاره دارد (et al. 2006 Dubey (.تعداد صفحه :147قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید