دانلود پایان نامه ارشد: کلون و بیان فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته: بیوتکنولوژی کشاورزی

عنوان : کلون و بیان فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا

دانشگاه زنجان

دانشکده کشاورزی

پایان نامه جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته بیوتکنولوژی کشاورزی

عنوان:

کلون و بیان فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا (TNF-α)

اساتید راهنما:

دکتر علی حق نظری - دکتر سیاوش دستمالچی

استاد مشاور:

دکتر داود فرج زاده

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)چکیده:سایتوکاین ها خانواده ای از فاکتورهای رشد هستند که توسط سلول های سیستم ایمنی ترشح می شوند. این خانواده شامل اینترلوکین ها (IL)، اینترفرون ها (IFN)، فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)، کموکاین ها و سایر فاکتورهای رشد می باشند. فاکتور نکروز کنندۀ تومور، بعنوان یک مولکولی با خصوصیات آنتی توموری است که عمدتاً توسط ماکروفاژهای تحریک شده با باکتری ترشح می شود. علیرغم ابنکه مقادیر محدودی TNF-α از منابع طبیعی آن بدست می آید اما مقادیر زیادی از فرم محلول آن (مورد نیاز برای مطالعات ساختاری و عملکردی) را می توان به آسانی توسط تکنولوژی DNA نوترکیب به دست آورد. بنابراین ترجیح داده می شود برای تولید این پروتئین نوترکیب از سیستم های ساده میکروبی و نیز گیاهان استفاده گردد.در اینجا به منظور مطالعه بیان TNFα انسانی، cDNA کد کنندۀ hTNFα حاصل از RT-PCR ی mRNA سلول های ماکروفاژ انسان، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی از قبل طراحی شده تکثیر گردید. محصول PCR خالص سازی شده، در سایت برشی EcoRV که در داخل ناحیه کد کننده مقاومت به تتراسایکلین در pBR322 بود، الحاق شد. سرانجام به منظور بیان، ژن هدف در پلاسمید  تحت کنترل سیگنال های رونویسی و ترجمه قوی پروموتور باکتریوفاژ T7 کلون گردید به این ترتیب که وکتور نوترکیب و نیز هر دو با آنزیم های NdeI-HindIII بریده شده و قطعهDNA bp 478 حاصل از برش pBRtnf در pET21a(+) خطی شده، اتصال و سپس در E. coli DH5α ترانسفورم شد. پس از بررسی صحت کلونینگ (توسط تکنیک PCR و آنزیم های برشی) و توالی یابی قطعه کلون شده، بیان سیتوپلاسمی hTNFα نوترکیب در سویه BL21(DE3) E.coli از طریق تکنیک های  SDS-PAGEو نیز وسترن بلاتینگ مورد تایید قرار گرفت.مقدمه:فاکتور نکروز کننده تومور آلفا (TNF-α) سایتوکاینی پیش التهابی است که در راه اندازی و تنظیم سیستم ایمنی ذاتی و پاسخ های التهابی حاد در برابر باکتری های گرم منفی و سایر میکروب های بیماری زا از طریق فراخوانی نوتروفیلها و منوسیت ها به محل عفونت دخالت دارد. TNF-α برای اولین بار از سرم موش ها و خرگوشهایی که با سویه BCG مایکوباکتریوم بوویس یا آندوتوکسین باکتری ها تیمار شده بودند جداسازی شد که در مرگ سلول های توموری نقش ایفاء می کرد. اگر چه وجه تسمیه این فاکتور به علت ویژگی های ضد توموری آن است اما این پلی پپتید 17 کیلودالتونی دارای عملکردهای متعددی نظیر دخالت در آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول، التهاب، تنظیم خواب و رشد رویان می باشد.این فاکتور غالباً توسط ماکروفاژهای فعال، لنفوسیت هایT  ی CD4+، لنفوسیت هایT  ی CD8+، سلول های NK و ماست سل ها بیان می شوند. بیان آن در سلول های دیگر مانند فیبروبلاست ها، سلول های عضلات صاف و سلول های توموری پایین است.TNF-α نوترکیب امروزه به طور گسترده در تحقیقات علوم پایه و بالینی و نیز به منظور درمان تومور مورد استفاده قرار می گیرد. لذا با توجه به اهمیت آن تولید و تخلیص TNF-α به شکل نوترکیب در موجودات پروکاریوتی در کشور می تواند باعث فراهم شدن زمینه جهت انجام تحقیقات بعدی نظیر تحقیقات ملکولی، پزشکی و بالینی بر روی این سایتوکاین مهم باشد. به علاوه امکان تولید آنتی بادی های منوکلونال و پلی کلونال برعلیه TNF-α که امروزه کاربردهای بسیار وسیعی در تشخیص و درمان بیماریهای مختلف دارند نیز فراهم می شود. از سوی دیگر با توجه به نقش ویژه TNF-α در مقابله با تومورهای سرطانی، تولید TNF نوترکیب می تواند دریچه ای نوین در برابر تحقیقات سرطان شناسی و نیز درمان تومورهای سرطانی فراروی محققین کشور بگشاید.1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­ های داروییبیوتکنولوژی (زیست فناوری)، مجموعه فنونی است که از سیستم زنده برای تولید یا تغییر فرآورده­های زیستی در جهت بهداشت و اقتصاد عمومی استفاده می­کند(Wallman, 1997). گر­چه استفاده از میکروارگانیسم­ها برای تولید فرآورده­های زیستی دارای سابقه طولانی است ولی در زمینه بیوتکنولوژی مدرن امروزی نظیر تکنیک­های مهندسی ژنتیک و تکنولوژی  DNAنو­ترکیب، کاربرد فراوان دارند. اصطلاح بیوتکنولوژی نخستین بار در سال 1917 توسط کارل ارکی[1] به کار برده شد. در سال 1973 هربرت بویر[2] و استنلی کوهن[3] تکنولوژی DNA نو­ترکیب را ارایه دادند و در سال 1976 اولین شرکت مستقل بیوتکنولوژی،­Genentech، به منظور تجاری کردن این تکنولوژی جدید تاسیس شد. در سال 1982 انسولین انسانی نو­ترکیب با استفاده از تکنولوژی DNA نوترکیب برای نخستین بار در E. coli به مرحله تولید رسید(Mckown and Coffman, 2002). پیش از بکار بردن روشهای بیوتکنولوژی، تنها منبع تولید پروتئین­های دارویی منابع طبیعی آنها نظیر خون و بافت­های انسانی و حیوانی بود که اغلب به میزان بسیار اندک و با صرف هزینه بسیار بالا تهیه می­شد. همچنین به دلیل مشکل بودن روشهای خالص سازی و از طرفی آلرژی­زا بودن پروتئین­های حیوانی برای انسان و امکان بروز اثرات جانبی، استفاده از این ترکیبات را محدود می­نمود(Brown, 2001). امروزه تکنولوژی DNA نو­ترکیب امکان آن را فراهم کرده است که بتوان cDNA کد کننده هر پروتئین را جدا کرده و به یک سیستم بیان کننده مناسب وارد کرد. در این حالت پروتئین مورد نظر در موجود بیگانه که اغلب یک میکروارگانیسم است، بیان می­شود(Glick and Eds, 1998). به این ترتیب می­توان پروتئین­های دارویی را در مقیاس انبوه و بسیار ارزان­تر از روش­های قبلی تولید نمود(Walsh and Headon, 1994).در حال حاضر بیش از 100 پروتئین دارویی نو­ترکیب برای درمان بیماری­های انسانی در بازار وجود دارد و در حدود 400 داروی جدید در درمان بیماری­های مختلف به ویژه سرطان، ایدز و ناراحتی­های دستگاه عصبی در مراحل کار آزمایی بالینی قرار دارند(Mckown and Coffman, 2002).تکنولوژی دارویی مدرن از کلون کردن ژن و تکنولوژی DNA نوترکیب بهره می­گیرد. هدف نهایی بیوتکنولوژی دارویی ژن درمانی و ورود مواد ژنتیکی به سلول­ها برای جلوگیری یا کنترل و یا معالجه بیماری می­باشد(Ossege, Sindern et al., 1998). جدول 1-1 برخی از پروتئین­های دارویی تولید شده به صورت نو­ترکیب (T. A. Brown) را نشان می­دهد.2-1- کلون کردن ژنکلون کردن عبارت است از به وجود آوردن نسخه کاملاً مشابه یک قسمت کوچکی از DNA، سلول و یا موجود کامل. کلون کردن ژن تحت عناوین کلون کردن مولکولی و تکنولوژی DNA نو­ترکیب نیز شناخته می­شود(Brown 1996). در این تکنیک یک توالی ژنی را جدا کرده و با آنزیم اختصاصی برش می­دهند. سپس با استفاده از آنزیمDNA  لیگاز[1] DNA مورد نظر در یک وکتور مناسب قرار داده می­شود. هیبرید حاصله را Construct DNA گویند. که با انتقال به باکتری و یا سلول میزبان امکان تکثیر آن فراهم می­شود(Maeyer and De Maeyer-Guignard, 1998). در سال 1973، نخستین DNA نو­ترکیب با استفاده از آنزیم­های برشی و آنزیم لیگاز در دانشگاه Stanford آمریکا ساخته شد.کشف تکنولوژی DNA نو­ترکیب سر­آغاز پیشرفت­های جدید در علوم و بیوتکنولوژی شد. یکی از خصوصیات مهم ژن کلون شده در تکنولوژی DNA نو­ترکیب، این است که اغلب می­تواند درون موجودی دیگر که کاملاً متفاوت با موجود اولیه است، فعالیت خود را انجام دهد(Michael and et., 1982). اهمیت اصلی کلون کردن ژن به دست آوردن مقادیر کافی از ژن­های مورد نظر برای تجزیه و تحلیل بعدی است و امکان آزمایشات ژنتیکی برای فهم مکانیسم­های دخیل در بیماری­های ژنتیکی و در نتیجه پیدا کردن راهکارهای مناسب برای تشخیص و درمان آنها را فراهم می­آورد. کلون کردن ژن همچنین در داروسازی امروزه برای ساخت داروها با ساختار پروتئین نقش اساسی دارد. در حال حاضر یکی از مهمترین راهکارهای استفاده درمانی از این فناوری در توسعه روش­های درمانی نوین از جمله ژن درمانی است.1-2-1- ابزار و عوامل کلون کردن ژنهمانطور که قبلاً ذکر شد اساس کلون کردن، برش دادن مولکول­های متفاوت DNA و اتصال دوباره آنها است. برای این کار ابزارهای مولکولی لازم است که مهمترین آنها آنزیم­های محدود کننده[1] و آنزیم لیگاز هستند.1-2-1-1- آنزیم­های برشیدر کلون کردن ژن، برای ایجاد یک مولکول  DNAی نو­ترکیب، ناقل بایستی به صورت کاملاً دقیق در یک نقطه مشخص(با امکان اتصال و برش دوباره) برش داده شود تا قطعه DNA که قرار است، کلونپ شود، در آن نقطه وارد گردد. اندونوکلئاز­های برشی، آنزیم­هایی هستند که قطعه DNA را در مکان­های اختصاصی برش می­دهند. اولین آنزیم برشی در سال 1970 از باکتری Haemophilus influenzae جداسازی شد. انواع مختلف باکتری­ها انواع متفاوتی از این آنزیم­ها را تولید می­کنند. به همین دلیل اسامی آنها معمولاً از نام باکتری­های مولد آنها مشتق شده است(McDonald, 1996).1-2-1-2- آنزیم DNA لیگازیکی از آنزیم­های مهم در سلول برای اتصال قطعات، DNA لیگاز نامیده می­شود که موجب بازسازی پیوندهای فسفودی­استری از هم گسیخته می­گردد. هر گاه  DNAی ناقل و  DNAی خارجی هر دو با یک آنزیم برشی بریده شوند، نواحی انتهایی متناظر در ناقل و  DNAی خارجی با یکدیگر سازگار بوده و مکمل یکدیگرند. و توالی­های تک رشته­ای انتهاهای مکمل با هم جفت می­شوند. لیگاز­ها روی قطعات برخوردار از گروه فسفات در انتهای '5 عمل کرده و با ایجاد پیوند فسفودی­استری سبب بر­قراری اتصال بین دو توالی DNA می­شوند، این فرایند که به اتصال[1] معروف است، آخرین مرحله ساخته شدن یک مولکول  DNAی نو­ترکیب است.در کلون کردن ژن­ها نوع آنزیمی که معمولاً مورد استفاده قرار می­گیرد، DNA لیگاز T4 است که از باکتری­های E. coli آلوده شده با باکتریوفاژ T4 به دست می­آید. زیرا این آنزیم هم قادر به اتصال رشته های  DNAی دو رشته­ای با انتهای صاف و هم با انتهای چسبان می­باشد در حالی که DNA لیگاز باکتری E. coli در اتصال قطعات با انتهای صاف ناتوان است. دمای بهینه فعالیت هر دو آنزیم در سیستم بیولوژیکی 37 درجه است. ولی از آنجا که برای اتصال قطعات جدا از هم و مکمل تشکیل اولیه پیوندهای هیدروژنی بین نوکلئوتیدهای مکمل ضروری است و در واکنش درون شیشه­ای[2] پیوندهای هیدروژنی، پایداری چندانی در مقابل دمای بالا ندارند به همین دلیل این نوع واکنش­ها در دماهای پایین 16-4 درجه سانتیگراد و به مدت طولانی انجام شود(McDonald, 1996).1-2-2- وکتورهای کلونینگبرای این که بتوان قطعه­ای از  DNAی دلخواه (موسوم به Insert DNA) را با استفاده از شرایط طبیعی (in vitro) تکثیر کرده و برای مطالعات بیشتر استفاده نمود، لازم است DNA را توسط مولکول­های وکتور به سلول­های مورد نظر انتقال داد. در غیر این صورت، عمل انتقال، تکثیر و یا استخراج  DNAی مورد نظر امکان­پذیر نمی­شود. نظر به این که قطعات تکثیر شده همه با هم یکسان هستند، این نوع متدولوژی به همسانه­سازی DNA موسوم است. مولکول­های وکتور DNA (DNAVector) که خود DNA می­باشند، بنا به داشتن توالی به خصوصی قادر هستند در سلول­های میزبان خود به تعداد زیادی تکثیر شوند. در این صورت قطعه  DNAی دلخواه نیز به همراه وکتور خود تکثیر می­شود.وکتورهای DNA تنوع بسیار زیادی دارند. مهمترین عامل طبقه­بندی آنها میزان ظرفیت حمل DNA به سلول میزبان است. قطعات DNA را می­توان از چند نوکلئوتید گرفته تا بیش از صد هزار نوکلئوتید توسط وکتورهای مناسب همسانه­سازی نمود. به همین دلیل در طراحی اولیه باید ابتدا اندازه  DNAی مورد نظر را مشخص و وکتور مناسبی انتخاب نمود. پلاسمیدها، فاژ λ، کاسمید و کروموزوم­های مصنوعی مخمر(Yeast artification chromosom) از وکتورهایی هستند که بیش از سایر وکتورها مورد استفاده قرار می­گیرد(Larry and Champness, 2007).مشخصات کلی وکتورهای کلونینگوکتورهای مختلف DNA با تنوع بسیار زیاد، شامل اندازه­ها و ظرفیت­های حمل مختلف موجود می باشند، ولی دارای نقاط مشترک اساسی ذیل هستند:مبدا همانند­سازی[1]همه وکتورها دارای توالی­های ویژه­ای هستند که توسط آنزیم DNA پلی­مراز سلول میزبان شناسایی شده و به تعداد بسیار زیادتر از ژنوم خود میزبان تکثیر می­شوند این توالی به مبدا همانند­سازی موسوم است و با Ori نشان داده می­شود. برخی وکتورها حاوی دو نوع Ori برای تکثیر در دو نوع سلول میزبان می باشند. همانند­سازی وکتور توسط DNA پلی­مراز سلول میزبان، در این ناحیه شروع و در دو جهت (Bi-directional) مخالف هم ادامه می­یابد.نشانگرهای انتخابی[2]همه وکتورها حامل ژن­هایی هستند که به واسطه ایفایش آنها می­توان وجود وکتور را به سهولت در داخل سلول میزبان ردیابی نمود. متداول­ترین نشانگرها، ژن­هایی هستند که فرآورده آنها باعث بروز مقاومت در برابر آنتی­بیوتیک­های به خصوصی می­شود. در صورتی که وکتور به داخل سلول میزبان حساس به یک آنتی­بیوتیک انتقال یابد، می­تواند در حضور همان آنتی­بیوتیک زنده مانده و رشد کند. انواع نشانگرهای رایجی که مقاومت به آنتی­بیوتیک به خصوصی را در سلول میزبان القاء می­کنند، آمپی سیلین[3]، تتراسایکلین[4]، جنتامایسین[5]، کانامایسین[6] و استرپتومایسین[7] می­باشند.نشانگرهای ژنتیکی[8]دسته دیگری از نشانگرها، ژن­هایی هستند که عامل کنترل یک سری واکنش­های بیوشیمیایی هستند. و در حضور مواد زمینه خاصی واکنش­های به خصوصی را بر­می­انگیزند. مثلاً ژن LacZ که استفاده از آن بسیار متداول می­باشد در صورت انتقال به سویه­ای از باکتری E. coli که این ژن را ندارد باعث تولید آنزیم بتا-گالاکتوزیداز می­شود که می­تواند روی ماده­ای بنام X-Gal اثر کرده و رنگ آبی در محیط اطراف سلول تولید کند. برای تشخیص اینکه سلول میزبان حاوی وکتور DNA است، استفاده از یک نوع نشانگر کافی است ولی برای اینکه بتوان ماهیت وکتور را در رابطه با حامل بودن DNA وارد شده بررسی نمود، استفاده از نشانگرهای ثانوی ضروری می­باشد.جایگاه کلونینگ متعدد[9] (MCS)برای اینکه بتوان DNA وارد شده را با استفاده از مکانیسم نوترکیبی[10] وارد قسمت خاصی از  DNAی وکتور کرد، در ساده­ترین روش کار لازم است با استفاده از آنزیم­های برش دهنده هر دو DNA را برش داده و قطعات برشی و سپس دو نوع DNA را به هم اتصال داد در وکتورهای جدید جایگاه کلونینگ یا MCS شامل توالی­هایی است که حاوی توالی­های شناسایی و جایگاه برش برای آنزیم­های برش دهنده متعدد می­باشد. در کلونینگ باید از آنزیم­هایی استفاده کرد که فقط می­توانند یکبار DNA وکتور را مورد برش قرار دهند به همین دلیل این جایگاه­ها را جایگاه برشی منحصر به فرد می­نامند. بنابر این MCS هر وکتور جایگاه برشی آنزیم­هایی را ارائه می­کند که در تمامی طول وکتور منحصر به فرد[11] هستند. اگر­چه وجود MCS در یک وکتور الزامی است اما این جایگاه باید در مکان ویژه­ای در روی وکتور قرار گرفته باشد به طور رایج این محل در ناحیه ´5 ژن LacZ قرار دارد که وجود آن در این محل در تولید فرآورده این نشانگر اختلالی ایجاد نمی­کند در صورت وارد کردن DNA در جایگاه MCS توالی این ژن مختل شده و عدم تولید کلونی­های آبی رنگ در حضور X-Gal وجود  DNAی وارد شده را نشان می­دهد.جایگاه ­های پروموتر[12]بسته به هدف کلونینگ، وکتورهای متفاوتی طراحی شده­اند و به منظور انجام عملیات مختلف، توالی­های ویژه­ای در یک یا دو ردیف MCS قرار داده شده­اند. این توالی­های الیگو­نوکلئوتیدی محل شناسایی و کنترل آنزیم­های مختلف از منابع متفاوت هستند که در سویه­های مختلفE. coli  موجود می­باشند. به این ترتیب بایستی برای اهداف و عملیات بخصوص، وکتور و سویه باکتری مناسب و سازگاری را انتخاب نمود. ممکن است هدف از کلونینگ تولید و تکثیر DNA هدف، تولیدmRNA  از  DNAی هدف یا این که تولید فرآورده پروتئینی کد شونده از  DNAی هدف باشد. وجود پروموترهای ویژه و آنزیم­های مربوطه انجام این نوع عملیات را بر­عهده دارند.مثلاً RNA polimerase از باکتریوفاژهای مختلف کلون شده و سویه­های ترا­ریخته E. coli حاوی این ژن­ها می­باشند. این نوع پلی­مرازها از  DNAهایی که در مجاورت توالی پروموتور مخصوص شان قرار داشته باشند، به تعداد زیادی نسخه­برداری کرده و mRNA ی زیادی تولید می­شود. این نوع وکتور به وکتور نسخه­برداری موسوم است.در صورتی که تولید مقادیر زیادی از پروتئین کد شونده توسط  DNAی هدف مد نظر باشد، توالی­هایی مربوط به پروموتر در ابتدای  DNAی هدف قرار می­گیرد که با بر هم کنش با ریبوزوم­ها و فاکتورهای تولید پروتئین در سلول، باعث بالا رفتن میزان تولید پروتئینی می­شود که به هیچ نحو مورد نیاز و استفاده باکتری نیست. این نوع وکتورها نیز به وکتور بیانی [13]موسوم هستند (محمود­پور،1381).[1]. Origen of replication[2]. Selective Markes[3]. Ampicillin[4]. Tetracycline[5]. Gentamicin[6]. Kanamycin[7]. Streptomycin[8]. Genetic Marker[9]. Multiple Cloning Site[10]. Recombination[11] . Unique Site[12] .Promoter Site[13]. Expression Vector[1]. Ligation[2]. In vitro[1]. Restriction enzymes[1]. Ligase1. Karl Ereky2. Herbert W.Boyer[3]. Stanly N.Cohenتعداد صفحه : 111قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید