دانلود پایان نامه ارشد : کلون و بیان فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا (TNF-α)

دانلود متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته بیوتکنولوژی کشاورزی

عنوان : کلون و بیان فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا (TNF-α)

دانشگاه زنجان

پایان نامه جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته بیوتکنولوژی کشاورزی

کلون و بیان فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا (TNF-α)

 

اساتید راهنما:

دکتر علی حق نظری – دکتر سیاوش دستمالچی

 

استاد مشاور:

دکتر داود فرج زاده

 

 

مهر 1388

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکیده

 
مقدمه

علایم اختصاری

 
فصل اول: بررسی منابع 
1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی1
2-1- کلون­کردن ژن3
                         1-2-1- ابزار و عوامل کلون­کردن ژن4
                                    1-1-2-1- آنزیم­های برشی4
                                   2-1-2-1- آنزیم DNA لیگاز5
                         2-2-1- وکتورهای کلونینگ6
                                     1-2-2-1- پلاسمیدها10
3-1- سیستم­های بیان کننده مورد استفاده در تولید پروتئین­های نو­ترکیب11
                       1-3-1- باکتری E. coli بعنوان میزبان بیان کننده پروتئین­های نو­ترکیب15
                       2-3-1- وکتور بیان­کننده15
                                    1-2-3-1- پروموتر16
                                               1-1-2-3-1- پروموتر T7 و سیستم بیانی PET17
                                    2-2-3-1- منشاء همانند­سازی18
                                   3-2-3-1- مارکر انتخابی18
                                    4-2-3-1- خاتمه دهنده رونویسی19
                                    5-2-3-1- سیگنالهای ترجمه یکی از عوامل مؤثر در افزایش بیان19
                                   6-2-3-1- انتخاب کدون20
4-1- مسائلی در مورد تولید پروتئین­های نو­ترکیب در اشرشیاکلی21
                        1-4-1- پایداری پلاسمید21
                       2-4-1- عدم حذف متیونین در انتهای N ترمینال پروتئین نو­ترکیب22
                        3-4-1- بار متابولیکی23
                        4-4-1- مشکلات بیان پروتئین­های نوترکیب در سیتوپلاسم باکتری اشرشیاکلی.23
5-1- سیستم ایمنی ذاتی و اکتسابی25
6-1- سایتوکاین­ها25
                        1-6-1- فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)26
                                     1-1-6-1- ویژگی­های ژن و مولکول TNFα27
                                     2-1-6-1- ویژگی های ساختاری پروتئین TNF28
                                     3-1-6-1- ساختار گیرنده TNF و سوپرفامیلی آنها29
                                     4-1-6-1- نقش بیولوژیکی TNFα31
                                     5-1-6-1- مکانیسم عمل31
7-1- TNF-α و نقش آن در برخی از بیماری­های تحلیل عصبی34
                       1-7-1- TNF و بیماری آلزایمر(AD)34
                       2-7-1- TNF و ایسکمی مغزی35
                       3-7-1- TNF و بیماری پارکینسون36
 دستگاه­های مورد استفاده 
فصل دوم : مواد و روش­ها 
1-2- نمونه­گیری از خون انسان38
2-2- استخراج ­RNAی کل از خون38
             1-2-2- وسایل لازم38
            2-2-2- روش کار39
3-2- سنتز cDNA40
                        1-3-2- روش کار41
4-2- کلونینگ cDNA­ ی کد کننده TNF-α­ی انسان41
                        1-4-2- طراحی جفت پرایمرها41
                        2-4-2- واکنش PCR42
                                     1-2-4-2- الکتروفورز با ژل آگاروز43
                                        1-1-2-4-2- مواد و وسایل مورد نیاز43
                                       2-1-2-4-2- روش کار43
                                      3-1-2-4-2- رنگ­آمیزی ژل آگارز با اتیدیوم بروماید43
                        3-4-2- خالص­سازی محصول PCR با استفاده از کیت44
                       4-4-2- کلونینگ cDNA کد کننده TNF-α در وکتور pBR32245
                                     1-4-4-2- انجام واکنش اتصال47
                                     2-4-4-2- ترانسفورماسیون محصول اتصال به باکتری47
                                     3-4-4-2- میزبان باکتریایی E. coli47
                                     4-4-4-2- کشت و نگهداری باکتری­ها48
                                      5-4-4-2- تهیه باکتریهای مستعد (Competent bacteria)

برای پذیرش DNA  پلاسمیدی خارجی

 

49

                              6-4-4-2- انتقال پلاسمید به درون سلول­های مستعد باکتریایی50
                                7-4-4-2- غربال کردن کلون‌های واجد پلاسمید نو­ترکیب و کشت کلونی باکتریایی.50
                              8-4-4-2- استخراج DNA پلاسمیدی نو­ترکیب51
                              9-4-4-2- تایید کلنی­های حاوی اینسرت توسط PCR و آنزیم­های برشی51
                       5-4-2- کلونینگ cDN­ی کد­کننده TNF-α در حامل pET2152
                                     1-5-4-2- برش حامل pET2152
                                    2-5-4-2- اتصال ­cDNAی TNF-α به حامل pET2154
                     6-4-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتریE.coli  سویه BL21(DH3) برای بررسی
پروتئین نوترکیب
54
                                   1-6-4-2- انتخاب کلون­های ترانسفورم شده و کشت کلنی­ها54
5-2- روش­های مربوط به بررسی بیان پروتئین hTNFα نو­ترکیب55
                        1-5-2- القاء بیان پروتئین نو­ترکیب55
                        2-5-2- تهیه نمونه پروتئینی جهت SDS-PAGE55
                                    1-2-5-2- SDS-PAGE56
                                    2-2-5-2- مواد لازم جهت SDS-PAGE57
                                    3-2-5-2- روش آزمایش57
                       3-5-2- وسترن بلاتینگ59
6-2- نرم­افزارها61
فصل سوم : نتایج 
1-3- نمونه­های خون62
2-3- استخراج RNA کل از خون62
3-3- سنتز cDNA کل63
                     1-3-3- تکثیر توالی کد­کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی63
4-3- کلون­سازی توالی کد کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی تکثیر شده با روش PCR در پلاسمید pBR322 و ساخت پلاسمید نو­ترکیب pBRtnf 

 

64

5-3- ساخت پلاسمید بیان کننده نو­ترکیب pET21tnf67
6-3- بررسی بیان پروتئین نو­ترکیب در E. coli71
7-3- مقایسه اثر غلظت­های مختلف IPTG در میزان بیان پروتئین72
8-3- بررسی میزان بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء73
9-3- وسترن بلاتینگ74
فصل چهارم : بحث 
4-1- بحث75
فصل پنجم : نتیجه­گیری و پیشنهادات 
نتیجه­گیری و پیشنهادات80
منابع مورد استفاده81
فهرست جداول

عنوان

جدول 1-1 : برخی از پروتئین­های نو­ترکیب موجود در بازار دارویی………………………..3
جدول 2-1 : معایب و مزایای سیستم­های بیان کننده مختلف جهت تولید پروتئین­های نوترکیب…….12
جدول 3-1 : تعدادی از پروموترهای مورد استفاده برای بیان ژن در E. coli…………..17
جدول 1-2 :ترکیبات مورد نیاز در سنتز cDNA…………………………………………………40
جدول 2-2 : ترکیب واکنش PCR(مقادیر بر حسب میکرولیتر)……………………………..42
جدول 3-2 : واکنش برش آنزیمی………………………………………………………………………46
جدول 4-2 :  ترکیبات واکنش اتصال  TNF-αو pBR322………………………………..47
جدول 5-2 : فهرست سویه‌های E. coli استفاده شده در این تحقیق……………………..47
جدول 6-2 : ترکیبات محیط کشت LB……………………………………………………………..48
جدول 7-2 : مخلوط واکنش برای برش آنزیمی……………………………………………………54
جدول 8-2 : اجزای واکنش اتصال……………………………………………………………………..54
جدول 9-2 : تهیه 12 میلی­لیتر محلول ژل پایین با غلظت 10 در صد………………………57
جدول 10-2 : تهیه 5 میلی لیتر محلول ژل بالا با غلظت 4 در صد………………………….57
جدول 11-2 : ترکیبات بافر نمونه (5x)……………………………………………………………..57
جدول 12-2 : ترکیبات بافر الکترود (بافر مخازن)…………………………………………………57

 

فهرست اشکال
شکل 1-1 : اجزاء اولیه و اصلی وکتور بیان­کننده ژن در E. coli………………………………..16
شکل 2-1: نقشه کروموزوم MHC انسان و ژن hTNFα…………………………………………27
شکل 3-1 : ساختار کریستالی TNFα بر گرفته از Protein Data Bank………………..29
شکل 4-1 : شکل 4-1 مسیر سیگنالی TNFR1………………………………………………………33
شکل 1-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pBR322 (اقتباس از فرمنتاس)…………………………..46
شکل2-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pET21a (+) (اقتباس از فرمنتاس)………………………53
شکل 1-3 : چهار نمونه خون انسان سالم………………………………………………………………..62
شکل 2-3 : الکتروفورز RNA کل استخراج شده از 4 نمونه خون با استفاده از کیت……63
شکل 3-3 : الکتروفورز محصول تکثیر شده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای نو­ترکیب با روش PCR و با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز………………………………..64
شکل 4-3 : نقشه پلاسمید نوترکیبpBR322tnf ………………………………………………….65
شکل 5-3 : الگوی برش نخورده پلاسمیدهای نو­ترکیب pBRtnf در مقایسه با pBR322 فاقد cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا……………………………………………………………66
شکل 6-3 : الکتروفورز محصول واکنش PCR بر روی پلاسمیدهای نو­ترکیب بر روی ژل آگارز………67
شکل 7-3 : نقشه پلاسمید نوترکیب pET21tnf…………………………………………………….68
شکل8-3 : نتایج الکتروفورز محصول  PCRپلاسمید نو­ترکیب pETtnf با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………………………………69
شکل 9-3 : الکتروفورز محصول پلاسمید نوترکیب pET21tnf برش یافته با آنزیم های NdeI، HindIII و بریده شده با دو آنزیم NdeI HindIIIبر روی ژل آگارز…………..70
شکل 10-3 : توالی نوکلئوتیدی ژن TNF و اسیدآمینه­ای ترجمه شده آن از یکی از کلون های نو­ترکیب به دست آمده، pET21tnf………………………………………………………71
شکل 11-3 : بیان ژن TNF-α انسانی در BL21 E. coli………………………………………72
شکل 12-3 : مقایسه غلظت­های مختلف IPTG بر روی بیان……………………………………73
شکل 13-3 : مقایسه بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء…………………………….73
شکل 14-3 : نتایج وسترن بلاتینگ بیان پروتئین نوترکیب در غلظت­های 0625/0، 125/0، 5/0و 1 میلی­مولار..74

علایم اختصاری:

LB: Luria Bertani

NK cell: Natural killer cell

OD: Optical Density

TNF: Tumor Necrosis Factors

TAE: Tris-acetate EDTA

SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis

RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction

rhTNF-α: Recombinant human Tumor Necrosis Factor alpha

MCS: Multiple cloning site

LPS: Lipopolysaccharide

IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

IL: Interleukin

INF: Interferon

EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid

DW: Distilled water

APS: Ammonium persulfate

MS: Multiple Sclerosis

TEMED: N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine or N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,2-diaminoethan

TE: Tris EDTA

TM: Melting temperature 

RCLB: Red Cell Lysis Buffer

CTL : Cytotoxic T cell

X-gal: bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside

MHC: Major Histocompatibility Complex

AD: Alzheimer’s disease

PD: Parkinson’s disease

LT: Lymphotoxin

TLR: Toll-like receptor

FADD: Fas-Associated protein with Death Domain

RIP: Receptor Interacting Protein

 

 

 

 

 

چکیده

سایتوکاین ها خانواده ای از فاکتورهای رشد هستند که توسط سلول های سیستم ایمنی ترشح می شوند. این خانواده شامل اینترلوکین ها (IL)، اینترفرون ها (IFN)، فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)، کموکاین ها و سایر فاکتورهای رشد می باشند. فاکتور نکروز کنندۀ تومور، بعنوان یک مولکولی با خصوصیات آنتی توموری است که عمدتاً توسط ماکروفاژهای تحریک شده با باکتری ترشح می شود. علیرغم ابنکه مقادیر محدودی TNF-α از منابع طبیعی آن بدست می آید اما مقادیر زیادی از فرم محلول آن (مورد نیاز برای مطالعات ساختاری و عملکردی) را می توان به آسانی توسط تکنولوژی DNA نوترکیب به دست آورد. بنابراین ترجیح داده می شود برای تولید این پروتئین نوترکیب از سیستم های ساده میکروبی و نیز گیاهان استفاده گردد.

در اینجا به منظور مطالعه بیان TNFα انسانی، cDNA کد کنندۀ hTNFα حاصل از RT-PCR ی mRNA سلول های ماکروفاژ انسان، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی از قبل طراحی شده تکثیر گردید. محصول PCR خالص سازی شده، در سایت برشی EcoRV که در داخل ناحیه کد کننده مقاومت به تتراسایکلین در pBR322 بود، الحاق شد. سرانجام به منظور بیان، ژن هدف در پلاسمید  تحت کنترل سیگنال های رونویسی و ترجمه قوی پروموتور باکتریوفاژ T7 کلون گردید به این ترتیب که وکتور نوترکیب و نیز هر دو با آنزیم های NdeI-HindIII بریده شده و قطعهDNA bp 478 حاصل از برش pBRtnf در pET21a(+) خطی شده، اتصال و سپس در E. coli DH5α ترانسفورم شد. پس از بررسی صحت کلونینگ (توسط تکنیک PCR و آنزیم های برشی) و توالی یابی قطعه کلون شده، بیان سیتوپلاسمی hTNFα نوترکیب در سویه BL21(DE3) E.coli از طریق تکنیک های  SDS-PAGEو نیز وسترن بلاتینگ مورد تایید قرار گرفت.

 


مقدمه

فاکتور نکروز کننده تومور آلفا (TNF-α) سایتوکاینی پیش التهابی است که در راه اندازی و تنظیم سیستم ایمنی ذاتی و پاسخ های التهابی حاد در برابر باکتری های گرم منفی و سایر میکروب های بیماری زا از طریق فراخوانی نوتروفیلها و منوسیت ها به محل عفونت دخالت دارد. TNF-α برای اولین بار از سرم موش ها و خرگوشهایی که با سویه BCG مایکوباکتریوم بوویس یا آندوتوکسین باکتری ها تیمار شده بودند جداسازی شد که در مرگ سلول های توموری نقش ایفاء می کرد. اگر چه وجه تسمیه این فاکتور به علت ویژگی های ضد توموری آن است اما این پلی پپتید 17 کیلودالتونی دارای عملکردهای متعددی نظیر دخالت در آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول، التهاب، تنظیم خواب و رشد رویان می باشد.این فاکتور غالباً توسط ماکروفاژهای فعال، لنفوسیت هایT  ی CD4+، لنفوسیت هایT  ی CD8+، سلول های NK و ماست سل ها بیان می شوند. بیان آن در سلول های دیگر مانند فیبروبلاست ها، سلول های عضلات صاف و سلول های توموری پایین است.

TNF-α نوترکیب امروزه به طور گسترده در تحقیقات علوم پایه و بالینی و نیز به منظور درمان تومور مورد استفاده قرار می گیرد. لذا با توجه به اهمیت آن تولید و تخلیص TNF-α به شکل نوترکیب در موجودات پروکاریوتی در کشور می تواند باعث فراهم شدن زمینه جهت انجام تحقیقات بعدی نظیر تحقیقات ملکولی، پزشکی و بالینی بر روی این سایتوکاین مهم باشد. به علاوه امکان تولید آنتی بادی های منوکلونال و پلی کلونال برعلیه TNF-α که امروزه کاربردهای بسیار وسیعی در تشخیص و درمان بیماریهای مختلف دارند نیز فراهم می شود. از سوی دیگر با توجه به نقش ویژه TNF-α در مقابله با تومورهای سرطانی، تولید TNF نوترکیب می تواند دریچه ای نوین در برابر تحقیقات سرطان شناسی و نیز درمان تومورهای سرطانی فراروی محققین کشور بگشاید.

1-1-     بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی

بیوتکنولوژی (زیست فناوری)، مجموعه فنونی است که از سیستم زنده برای تولید یا تغییر فرآورده­های زیستی در جهت بهداشت و اقتصاد عمومی استفاده می­کند(Wallman, 1997). گر­چه استفاده از میکروارگانیسم­ها برای تولید فرآورده­های زیستی دارای سابقه طولانی است ولی در زمینه بیوتکنولوژی مدرن امروزی نظیر تکنیک­های مهندسی ژنتیک و تکنولوژی  DNAنو­ترکیب، کاربرد فراوان دارند. اصطلاح بیوتکنولوژی نخستین بار در سال 1917 توسط کارل ارکی[1] به کار برده شد. در سال 1973 هربرت بویر[2] و استنلی کوهن[3] تکنولوژی DNA نو­ترکیب را ارایه دادند و در سال 1976 اولین شرکت مستقل بیوتکنولوژی،­Genentech، به منظور تجاری کردن این تکنولوژی جدید تاسیس شد. در سال 1982 انسولین انسانی نو­ترکیب با استفاده از تکنولوژی DNA نوترکیب برای نخستین بار در E. coli به مرحله تولید رسید(Mckown and Coffman, 2002). پیش از بکار بردن روشهای بیوتکنولوژی، تنها منبع تولید پروتئین­های دارویی منابع طبیعی آنها نظیر خون و بافت­های انسانی و حیوانی بود که اغلب به میزان بسیار اندک و با صرف هزینه بسیار بالا تهیه می­شد. همچنین به دلیل مشکل بودن روشهای خالص سازی و از طرفی آلرژی­زا بودن پروتئین­های حیوانی برای انسان و امکان بروز اثرات جانبی، استفاده از این ترکیبات را محدود می­نمود(Brown, 2001). امروزه تکنولوژی DNA نو­ترکیب امکان آن را فراهم کرده است که بتوان cDNA کد کننده هر پروتئین را جدا کرده و به یک سیستم بیان کننده مناسب وارد کرد. در این حالت پروتئین مورد نظر در موجود بیگانه که اغلب یک میکروارگانیسم است،

 

 

بیان می­شود(Glick and Eds, 1998). به این ترتیب می­توان پروتئین­های دارویی را در مقیاس انبوه و بسیار ارزان­تر از روش­های قبلی تولید نمود(Walsh and Headon, 1994).

در حال حاضر بیش از 100 پروتئین دارویی نو­ترکیب برای درمان بیماری­های انسانی در بازار وجود دارد و در حدود 400 داروی جدید در درمان بیماری­های مختلف به ویژه سرطان، ایدز و ناراحتی­های دستگاه عصبی در مراحل کار آزمایی بالینی قرار دارند(Mckown and Coffman, 2002).

تکنولوژی دارویی مدرن از کلون کردن ژن و تکنولوژی DNA نوترکیب بهره می­گیرد. هدف نهایی بیوتکنولوژی دارویی ژن درمانی و ورود مواد ژنتیکی به سلول­ها برای جلوگیری یا کنترل و یا معالجه بیماری می­باشد(Ossege, Sindern et al., 1998). جدول 1-1 برخی از پروتئین­های دارویی تولید شده به صورت نو­ترکیب (T. A. Brown) را نشان می­دهد.

تعداد صفحه : 113

قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09199970560        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

شماره کارت :  6037997263131360 بانک ملی به نام محمد علی رودسرابی

11

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید