دانلود پایان نامه دکتری : تشخیص عوامل اصلی باکتریایی اندومتریت پس از زایش به روش multiplex PCR در گاوهای شیری

عنوان : بررسی تشخیص عوامل اصلی باکتریایی اندومتریت پس از زایش به روش multiplex PCR در گاوهای شیری

دانشگاه شیراز

دانشکده­ ی دامپزشکی

 

رساله‌ی دکتری تخصصی در رشته ­ی

مامایی و بیماری­های تولید مثل دام

 

 

 

بررسی تشخیص عوامل اصلی باکتریایی اندومتریت پس از زایش به روش multiplex PCR در گاوهای شیری

استادان راهنما

دکتر محمد رحیم احمدی

دکتر مسعود حق­خواه

آذر 1392

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)چکیدهدوره پس از زایمان به دلیل اثرات آن بر کارایی تولید­مثلی و آبستنی مجدد، مرحله­ای مهم در زندگی تولید مثلی گاو ماده محسوب می­شود. Escherichia coli، Trueperella pyogenes (Arcanobacterium pyogenes)، Fusobacterium necrophorum و Prevotella melaninogenicus به عنوان مهم­ترین باکتری­های بیماری­زای مرتبط با آسیب­های اندومتریوم رحم شناخته شده­اند. هدف این مطالعه تشخیص این باکتری­های بیماری­زا با استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) به عنوان یک روش حساس و بی­نیاز از کشت باکتری بود. تعداد 172 راس گاو 25 تا 35 روز پس از زایش و 128 راس دو هفته پس از آن (39 تا 49 روز پس از زایش) معاینه شدند. ترشحات رحمی با پیپت پلاستیکی پوشش­دار جمع آوری شدند. شیوع اندومتریت در اولین معاینه از دومین معاینه بالاتر بود (%5/35 در مقابل %16). E. coli در 8 نمونه، T. pyogenes در 13 نمونه و F. necrophorum در 11 نمونه یافت شد. هیچ نمونه مثبتی از P. melaninogenicus شناسایی نگردید. آلودگی رحمی با باکتری­های T. pyogenes و F. necrophorum در اولین معاینه بالاتر از دومین معاینه بود. باکتری T. pyogenes بر گرایش به ابتلای به اندومتریت بالینی اثر گذاشته بود. گاوهای شکم اول در مقایسه با گاوهای شکم دوم 02/4 برابر خطر بیشتر برای ابتلا به اندومتریت بالینی نشان دادند. یک پروتکل multiplex PCR به عنوان یک روش ساده­تر، ارزان­تر و سریع­تر برای شناسایی سه باکتری E. coli، T. pyogenes و F. necrophorum تنظیم و معرفی گردید.کلید واژه: اندومتریت، عوامل باکتریایی، PCR   فهرست مطالب  عنوان                                                                                                                      صفحه  فصل اول: مقدمه.......................................................................................................................................... 2 فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته2-1- فیزیولوژی پس از زایش............................................................................................................. 82-1-1- مکانیسم بازسازی رحمی............................................................................................... 82-1-2- آلودگی و پاک شدن باکتری­ها از رحم پس از زایش............................................ 92-1-3- عفونت باکتری­های بیماری­زا در رحم........................................................................ 92-1-4- فعالیت تخمدانی پس از زایش در گاوهای شیری................................................ 102-2- تعریف بیماری­های رحمی....................................................................................................... 112-2-1- متریت................................................................................................................................ 112-2-2- پیومتر................................................................................................................................ 112-2-3- اندومتریت......................................................................................................................... 122-2-3-1- اندومتریت بالینی................................................................................................ 122-2-3-2- اندومتریت تحت بالینی..................................................................................... 122-3- شیوع عفونت رحمی................................................................................................................. 132-4- روش­های تشخیص اندومتریت بالینی و تحت بالینی....................................................... 142-4-1- ملامسه رحم.................................................................................................................... 14عنوان                                                                                                                      صفحه  2-4-2- ارزیابی ترشحات مهبل و گردن رحم........................................................................ 142-4-3- اولتراسونوگرافی.............................................................................................................. 152-4-4- سلول شناسی اندومتریوم............................................................................................. 162-4-5- بیوپسی رحمی و باکتری شناسی.............................................................................. 172-5- درمان اندومتریت در گاوهای شیری..................................................................................... 182-5-1- استفاده از پروستاگلاندین­ها........................................................................................ 182-5-2- درمان آنتی بیوتیکی داخل رحمی............................................................................ 192-6- واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)......................................................................................... 21 فصل سوم:  روش کار3-1- انتخاب حیوانات.......................................................................................................................... 243-2- معاینات بالینی............................................................................................................................ 253-3- تهیه نمونه­های سلول شناسی................................................................................................ 263-4- جمع­آوری نمونه­های ترشحات رحمی................................................................................. 263-5- استخراج DNA از مایعات رحمی......................................................................................... 273-6- تشخیص حضور E. coli، T. pyogenes،  F. necrophorumو P. melaninogenicus با PCR........................................................................................................ 273-7- واکنش زنجیره­ای پلیمراز چندتایی (multiplex PCR) برایباکتری­های E. coli، T. pyogenes و  F. necrophorum......................................................... 293-8- بررسی شاخص­های تولیدمثلی............................................................................................... 303-9- آزمون­ها و تحلیل­های آماری................................................................................................... 30  عنوان                                                                                                                      صفحه  فصل چهارم:  نتایج4-1- معاینه اول.................................................................................................................................... 334-1-1- ابتلای به اندومتریت بالینی ....................................................................................... 334-1-2- باکتری شناسی............................................................................................................... 344-1-3- شاخص­ها و عوامل تولیدمثلی..................................................................................... 354-2- معاینه دوم.................................................................................................................................... 364-2-1- ابتلای به اندومتریت بالینی......................................................................................... 364-2-2- باکتری شناسی............................................................................................................... 374-2-3- شاخص­ها و عوامل تولید مثلی................................................................................... 384-3- مقایسه نخستین و دومین معاینه.......................................................................................... 39 فصل پنجم: بحث5-1- واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)......................................................................................... 495-2- باکتری شناسی........................................................................................................................... 515-3- اندومتریت بالینی و دیگر شاخص­های تولید مثلی............................................................ 54 فهرست منابع.............................................................................................................................................. 59فهرست جداول  عنوان                                                                                                                      صفحه  جدول 1. پرایمرهای استفاده شده در شناسایی ژن­های هدف........................................................ 28جدول 2. تعداد موارد سالم و مبتلا به اندومتریت بالینی در معاینه اول و دوم.......................... 42جدول 3. مقایسه وضعیت بدنی، روزهای باز و درصد نوتروفیل گردن رحمدر ابتلا به اندومتریت بالینی در طی معاینه اول و دوم (Mean±SE)............................................ 42جدول 4. موارد مثبت PCR در گاوهای سالم و مبتلا به اندومتریت بالینیدر معاینه اول و دوم..................................................................................................................................... 42جدول 5. ضریب همبستگی آلودگی باکتریایی با یکدیگر در معاینه اول...................................... 43جدول 6. ضریب همبستگی آلودگی باکتریایی با یکدیگر در معاینه دوم..................................... 43جدول 7. ضریب همبستگی آلودگی به باکتری­ها و ساختار تخمداندر معاینه اول با شاخص­های تولیدمثلی ................................................................................................ 43جدول 8. ضریب همبستگی آلودگی به باکتری­ها و ساختار تخمداندر معاینه دوم با شاخص­های تولیدمثلی ............................................................................................... 43جدول 9. مقایسه روزهای باز در آلودگی باکتریایی نمونه­های رحمیدر معاینه اول و دوم (Mean±SE)........................................................................................................... 44جدول 10. مقایسه درصد نوتروفیل ترشحات گردن رحم در آلودگی باکتریایینمونه­های رحمی در معاینه اول و دوم (Mean±SE)......................................................................... 44جدول 11. مقایسه وضعیت بدنی، روزهای باز و درصد نوتروفیل گردن رحمدر قطرهای متفاوت گردن رحم (سانتی­متر) در طی معاینه اول و دوم (Mean±SE)............... 44عنوان                                                                                                                      صفحه  جدول 12. مقایسه وضعیت بدنی، روزهای باز و درصد نوتروفیل گردن رحمدر دو شاخ رحم متقارن و نامتقارن در طی معاینه اول و دوم (Mean±SE)................................ 45جدول 13. مقایسه وضعیت بدنی، روزهای باز و درصد نوتروفیل گردن رحمدر رحم­های واجد و فاقد لومن در طی معاینه اول و دوم (Mean±SE)..................................... 45جدول 14. مقایسه وضعیت بدنی، روزهای باز، درصد نوتروفیل و تعداد تلقیحدر ساختارهای غالب متفاوت تخمدانی در طی معاینه اول و دوم (Mean±SE)......................... 46جدول 15. ضریب همبستگی شاخص­های تولیدمثلی با یکدیگر.................................................... 46جدول 16. عوامل خطر همراه با احتمال وقوع اندومتریت بالینی تشخیص داده شدهدر معاینه اول و دوم..................................................................................................................................... 47فهرست تصاویر  عنوان                                                                                                                      صفحه  تصویر 1. محصولات PCR استاندارد DNA ژنومی ترشحات رحمی............................................. 40تصویر 2. محصولات واکنش زنجیره­ای استاندارد و چندتایی DNA ژنومیترشحات رحمی برای باکتری­های E. coli، T. pyogenes، F. necrophorumو P. melaninogenicus.............................................................................................................................. 41مقدمه  دوره پس از زایمان به دلیل اثراتی که بر کارایی تولید­مثلی و آبستنی مجدد دارد، به عنوان یک مرحله مهم در زندگی تولید مثلی گاو ماده محسوب می­شود. آلودگی رحم به باکتری­ها، به طور معمول در طی دو هفته ابتدایی پس از زایش رخ می­دهد (Noakes et al. 2009; Sheldon and Dobson 2004). 80 تا 100 درصد گاوها آلودگی باکتریایی رحم را در دو هفته اول پس از زایش دارند (Földi et al. 2006). در این مدت دامنه وسیعی از فلور میکروبی در رحم تکثیر می­کنند. هر چند رحم بیشتر گاوها در فرایندهای بازسازی رحم و بازگشت آن به اندازه طبیعی، در طی پنج هفته اول پس از زایش، از این آلودگی­های باکتریایی پاک می­شوند اما در تعدادی از گاوها این آلودگی­ها توسعه پیدا کرده و عفونت­های رحمی قابل تشخیص با معاینه بالینی را ایجاد می­کنند (Noakes et al. 2009; Sheldon et al. 2006a).اندومتریت پس از زایش به صورت التهاب محدود به اندومتریوم (لایه داخلی رحم) که 21 روز یا بیشتر پس از زایش و بدون نشانه­های بیماری عمومی رخ می­دهد، تعریف شده است (Sheldon et al. 2006a). تشخیص اندومتریت بالینی با قطر گردن رحم بیش از 5/7 سانتی­متر در ملامسه راست روده­ای بعد از روز 20 پس از زایش یا از حضور ترشحات مهبلی موکوسی-چرکی یا چرکی بعد از روز 26 پس از زایش تعریف شده است (LeBlanc et al. 2002a).میزان شیوع اندومتریت در کشورهای مختلف بسیار متفاوت بوده است. این میزان از 5/4-6/2 در اسپانیا (Lopez-Gatius 2003)، 10 درصد در بریتانیا (Noakes et al. 2009)، 25 درصد در ژاپن (Gautam et al. 2009)، تا 53 درصد در ایالات متحده (Gilbert et al. 2005) متغیر بوده است که این تفاوت می­تواند به دلیل عدم توصیف روش­های تشخیصی، معیارهای متفاوت درجه بندی عفونت­های رحمی، دوره پس از زایشی که هنگام تشخیص عفونت گاو در آن قرار داشته، تعداد زایش گاو و مدیریت متفاوت گله­ها باشد (Lewis 1997; Noakes et al. 2009). در مطالعات قبلی در گاوداری­های ایران میزان وقوع اندومتریت بالینی درجه 1 تا 3 بیش از 50 درصد بود (احمدی و همکاران، اطلاعات منتشر نشده).اندومتریت تاثیرات نامناسب بر تولید­مثل و باروری گاو گذاشته و خسارات اقتصادی فراوانی را وارد می­آورد. حضور باکتری در رحم، التهاب و آسیب­های بافتی اندومتریوم را در پی دارد و سبب تأخیر در بازسازی رحم و همچنین به خطر افتادن حیات رویان می­شود (Azawi 2008; Sheldon et al. 2006a). همچنین عفونت باکتریایی رحم و یا مواد تولید شده از این باکتری­ها سبب سرکوب ترشح LH هیپوفیز و نقص در عملکرد و رشد فولیکول­های تخمدانی پس از زایمان و در نتیجه اختلال در تخمک­گذاری می­شود (Opsomer et al. 2000; Sheldon et al. 2002b). بنابراین اندومتریت سبب کاهش احتمال باروری شده و افزایش فاصله زایش تا اولین تلقیح و افزایش نسبت تلقیح به ازای آبستنی (از 2 به 42/2) و افزایش فاصله زایش­ها (10 تا 31 روز) را در پی دارد (Azawi 2008; LeBlanc et al. 2002a; Noakes et al. 2009). گاوهای مبتلا به ترشحات مهبلی چرکی برای آبستن شدن به میانگین 30 روز زمان بیشتر نسبت به گاوهای غیر مبتلا نیاز دارند که حداقل ضرر اقتصادی طولانی شدن روزهای باز را دارد که حدود 3 دلار در روز می­باشد (Dubuc 2011). پس اندومتریت می­تواند سبب کاهش میزان باروری و افزایش نرخ حذف به دلایل ناباروری شود. نتیجه اینکه اندومتریت می­تواند اثر فراوانی در کاهش سودآوری گله­های گاو شیری داشته باشد. این خسارات به دلیل افزایش فاصله زایمان تا آبستنی مجدد، افزایش میزان حذف، کاهش تولید شیر و تحمیل هزینه­های درمان می­باشد (Drillich 2006; LeBlanc et al. 2002a) به گونه­ای که خسارات آن را برای هر گاو مبتلا 166 پوند (Noakes et al. 2009) محاسبه کرده­اند.عوامل بیماری­زای اندومتریت بسیار پیچیده هستند. بسیاری از مطالعات پیشنهاد کرده­اند که باکتری­های بیماری­زا نقش مهمی در بروز و وخیم شدن اندومتریت دارند (Sun et al. 2011).  معمول­ترین شروع کننده­های عفونت اندومتریت باکتری­های بیماری­زای فرصت طلب غیر اختصاصی هستند که در اطراف زمان زایمان و پس از آن رحم را آلوده می­کنند (Sheldon et al. 2006a). به نظر می­رسد عفونت رحم به Escherichia coli در اوایل دوره پس از زایش، راه را برای عفونی شدن توسط سایر باکتری­ها هموار می­کند (Westermann et al. 2010; Williams et al. 2005). متعاقب آن رشد زیاد باکتری­های بیماری­زایی چون pyogenes  Trueperella (Arcanobacterium pyogenes) (که معمولا باکتری­هایی چونFusobacterium necrophorum  و Prevotella melaninogenicus همراه با آن هستند) به لایه­های اندومتریوم نفوذ می­کنند (Drillich 2006; Noakes et al. 2009; Sheldon et al. 2006a). میزان عفونت ایجاد شده و نتیجه آلودگی را گونه باکتری بیماری­زا، میزان باکتری وارد شده و توانایی گاو برای بروز پاسخ ایمنی مناسب تعیین می­کنند که می­تواند از عفونت رحمی شدید همراه با به خطر افتادن زندگی تا عفونت خفیف لایه داخلی رحم متغیر باشد (Noakes et al. 2009; Sheldon and Dobson 2004). گرچه در پایدار شدن و باقی ماندن عفونت در رحم عواملی چون مساعد بودن محیط رحم، فاکتورهای ژنتیکی و ایمنی ذاتی و اکتسابی حیوان دخالت دارند اما شدت اندومتریت و آسیب­های وارده به رحم ارتباط مستقیمی با جنس و گونه باکتری­های آن دارد. Trueperella pyogenes معمول­ترین باکتری مرتبط با بیماری­های رحمی و اندومتریت است (Bicalho et al. 2010; Sheldon et al. 2004; Yavari et al. 2007). در کنار آن باکتری­هایی چون Fusobacterium necrophorum و  melaninogenicus Prevotella و Escherichia coli  از دیگر باکتری­های بسیار مطرح در آسیب­های رحمی و در رده اول بیماری­زایی برای رحم هستند (Sheldon and Dobson 2004; Williams et al. 2005). در ضمن این باکتری­ها به رشد همدیگر کمک کرده و اثرات هم را تشدید می­کنند (Sheldon and Dobson 2004; Westermann et al. 2010). به گونه­ای که T. pyogenes کمک به ایجاد محیط بی­هوازی برای رشدF. necrophorum  وmelaninogenicus  P. می­کند. F. necrophorum اندوتوکسین کشنده سلول­های دفاعی را تولید می­کند که توانایی سیستم دفاعی میزبان برای پاکسازی رحم از T. pyogenes را محدود می­کند. در همین حال  melaninogenicus  P. مواد تداخل کننده در فاگوسیتوز را تولید می­کند (Sheldon and Dobson 2004). در نتیجه این سه باکتری معمولا در کنار هم و در ارتباط با هم جداسازی شده­اند.با توجه به اینکه اندومتریت اثری بر سلامت ظاهری گاو مبتلا ندارد از روش­های گوناگونی برای تشخیص آن در گاو استفاده کرده­اند (Youngquist and Threlfall 2007) که شامل: ملامسه رحم از راه راست­روده (Drillich 2006; Lewis 1997)، بررسی حضور ترشحات چرکی در واژن و دهانه خارجی گردن رحم (LeBlanc et al. 2002a; Williams et al. 2005)، اولتراسونوگرافی (Barlund et al. 2008; Oral et al. 2009)، بیوپسی رحم و مطالعات آسیب­شناسی (Bonnett et al. 1991)، مطالعات سلول شناسی (Ahmadi et al. 2005; Oral et al. 2009; Yavari et al. 2009) و مطالعات میکروب­شناسی (Földi et al. 2006; Yavari et al. 2007) می­باشد اما این روش­ها بیشتر برای تایید اندومتریت استفاده می­شوند و کمتر برای تشخیص عامل بیماری­زا قابل استفاده هستند یا اینکه وقت­گیر، با حساسیت پایین و پیچیده هستند.باید توجه داشت که تشخیص قطعی اندومتریت بر اساس معاینه بافت­شناسی و آسیب­شناسی از نمونه­های بیوپسی اندومتر و یا با بررسی باکتری­شناسی نمونه­های جمع­آوری شده از مجرای رحم قابل اطمینان است. با توجه به اینکه بیوپسی بر بافت رحم و گردن رحم اثرات نامطلوب گذاشته و ناباروری ایجاد می­کند، استفاده از آن روشی قابل توصیه و مناسب نمی­باشد (Youngquist and Threlfall 2007). اما در کشت باکتری­ها نیز محدودیت­هایی وجود دارد که استفاده از آنها را دچار ابهام می­کند. به عنوان مثال، برای کشت برخی باکتری­ها مثلF. necrophorum  باید شرایط خاص (اجبار در استفاده از محیط کشت اختصاصی، ایجاد شرایط خاص بی­هوازی و همچنین مدت زمان طولانی مورد احتیاج برای کشت) فراهم شود که این روش را تبدیل به فرایندی زمان­بر، هزینه­بر و با زحمت زیاد کرده است. نکته مهم دیگر اینکه در مطالعات باکتری شناسی جدا شدن باکتری به عنوان دلیلی قاطع مبنی بر وجود عفونت در رحم تلقی می‌شود، چنانچه از آن به عنوان یک شاخص برای تعیین موارد مثبت کاذب روش واژینوسکوپی استفاده شده است (Westermann et al. 2010) ولی در صورتی که چرک مشاهده و باکتری جدا نشود نمی‌توان نتیجه گرفت که وجود چرک، ناشی از التهاب غیر عفونی است به خصوص در مورد باکتری­های سخت رشد و بی­هوازی چونF. necrophorum  وmelaninogenicus  .P. در بسیاری مطالعات تعداد زیادی نمونه رحمی بدون رشد هیچ گونه باکتری گزارش شده است (Ahmadi et al. 2007; Westermann et al. 2010). از جمله در مطالعه یاوری و همکاران از کشت رحم 89 راس گاو مبتلا به اندومتریت بالینی تهیه شده از گاوداری­های 5 استان، فقط از 35 مورد (3/39 درصد) باکتری جدا شد و تنها در 19 گاو دو باکتری بیماری­زای اصلی (T. pyogenes و E. coli) مشاهده شد (Yavari et al. 2007). در صورت مشاهده چرک و جدا نشدن باکتری (7/60 درصد) نمی‌توان نتیجه گرفت که وجود چرک، ناشی از التهاب غیر­عفونی است. بنابراین معرفی و استفاده از روش­هایی که کاستی­ها و مشکلات مطالعات باکتری شناسی بر مبنای کشت را از میان بردارد، دارای اهمیت بسیار است و احتیاج است که تعیین شود آیا روش­های پیچیده­تر مثل PCR دقت تشخیص را افزایش خواهند داد (Westermann et al. 2010).در حال حاضر PCR به عنوان یک فن­آوری قدرتمند برای تشخیص و توصیف میکروارگانیسم­ها بدون احتیاج به کشت تایید شده است (Guo et al. 2012). برخی تلاش­ها برای شناسایی باکتری­ها از ترشحات رحمی توسط PCR صورت گرفته است (Bicalho et al. 2012; Guo et al. 2012; Liu et al. 2009). به کار گرفتن روش multiplex PCR سبب سهولت و افزایش سرعت انجام کار و هزینه کمتر نسبت به روش استاندارد می­شود (Tramuta et al. 2011) اما پروتکل­های اندکی برای تشخیص عوامل عفونی ترشحات اندومتریت به روش multiplex PCR پیشنهاد شده­اند (Sun et al. 2011).بنابراین اهداف این مطالعه در ابتدا جستجوی باکتری­های بیماری­زای اصلی رحم (T. pyogenes، F. necrophorum، melaninogenicus P. و E. coli) در گاوهای مبتلا به اندومتریت به روش PCR بود. در روش PCR بررسی­ها مستقیم بر روی ژنوم نمونه صورت می­گیرد و در صورت حضور باکتری قطعه­های خاص از DNA آن را تکثیر کرده و حضور آن را با حساسیت بسیار معین می­کند. این روش شناسایی باکتری­هایی را که در محیط­های کشت سخت­رشد و دیر رشد هستند مثل F. necrophorum وmelaninogenicus  P. امکان­پذیر می‌سازد. چنانچه در مطالعه‌ای وسیع کشت باکتریایی از رحم گاوهای مبتلا به اندومتریت بالینی انجام داده شد اما دو باکتری نامبرده فوق جدا نشدند (Yavari et al. 2007). همچنین تلاش شد تا یک پروتکل multiplex PCR برای این باکتری­های بیماری­زا طراحی شود. بررسی رکورد شاخص­های تولید­مثلی در راستای شناسایی اثرات ابتلا با باکتری­های اصلی بیماری­زای رحم گاوهای شیری نیز از دیگر اهداف مطالعه بود.تعداد صفحه : 85قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید