دانلود پایان نامه : بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب FGFR2b و بررسی تغییرات ساختاری آن بر اثر برهمکنش با فلزات سمی

دانلود متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته بیوتکنولوژی پزشکی

عنوان : بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب  FGFR2b و بررسی تغییرات ساختاری آن بر اثر برهمکنش با فلزات سمی

دانشگاه علوم پزشکی قزوین

 

دانشکده پیراپزشکی

پایان نامه کارشناسی ارشد

گروه بیوتکنولوژی پزشکی

عنوان:

بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب  FGFR2b و بررسی تغییرات ساختاری آن بر اثر برهمکنش با فلزات سمی

استاد راهنما:

دکتر نعمت الله غیبی

 

اساتید مشاور:

دکتر داریوش ایلغاری

دکتر مجید سیرتی ثابت

زمستان 93

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)فهرست اختصارات   AB: Acid BoxAl: AluminiumAP-1: Activator protein 1 APS: Ammonium PersulfateASK: Apoptosis signal-regulating kinaseATP: Adenosine TriphosphateBDNF: brain-derived neurotrophic factor  Beas-2B: Human bronchial epithelial cellsBFGF: Basic Fibroblast Growth FactorCA-1: cornu ammonis 1CaMKII: Ca²+–calmodulin dependent protein kinase IICAMs: Calcium-Modulated ProteinCCR7: C-C chemokine receptor type 7Cd: CadmiumCD: Circular Dichroism CHO: Chinese hamster ovaryCNS: central nervous system DAG: diacylglycerolDGK: Diacyl glycerol kinaseDLS: Dynamic light scatteringDNA: Deoxyribonucleic acid ERK: Extracellular Signal-Regulated KinasesFDA: Food and Drug AdministrationFGFBP: Fibroblast growth factor binding proteinFGFR: Fibroblast Growth Factor ReceptorFgp: Floral Genome Project FRS2: Factor receptor substrate 2FTIR: Fourier Transform Infrared SpectroscopicGab1: Grb2-associated binder-1GnHCl: Guanidinium HydrochlorideGDP: guanidine di-phosphateGRB2: growth factor receptor-bound protein 2 GST: Glutathione S-TransferaseGTP: guanidine tri-phosphateHEPES: Hydroxyethyl-Piperazine Ethanesulafonic AcidHIF-1: Hypoxia-inducible factor 1HSGAG: Heparan Sulfate GlycosaminoglycanIARC: Agency for Research on CancerIL: InterleukinIP3: inositol 1, 4, 5-trisphosphate IPTG: Isopropyl β- D -1-thiogalactopyranosideIQ: intelligence quotient Itk: Interleukin-2inducible T cell kinaseJNK: c-Jun NH2-terminal kinase KD: kinase domainLADD: Lacrimo-auriculo-dento-digitalLTP: long-term potentiationMAPK: mitogen-activated protein kinaseMBP: Maltose-Binding ProteinNFAT: Nuclear factor of activated T cellNF-kB:  nuclear factor kappa betaNi: Nickle NTA: Ni (2+)-Nitrilotriacetic Acid- 2+ NiNMDAR: N-methyl-D-aspartate receptorNO: nitric oxideNTP: National Toxicology ProgramPA: phosphatidic acidPb: Plumbum (Lead)PI3K: Phosphatidylinositol-3 kinasePIP3: Phosphatidylinositol (3, 4, 5)-trisphosphatePLEICS-01: Plasmid Leicester-01PMT: Photomultiplier tubesPTP: Protein-Tyrosine Phosphatase RAF: rapidly accelerated fibrosarcomaRNA: Ribo nucleic acidROS: Reactive oxygen speciesSAPK: stress-activated protein kinase SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis PAGE Sef: similar expression to FGF genesSH3: Src homology 3SOD: Superoxide dismutaseTEMED: N, N, N', N' - tetramethyethylenediamineTNF: Tumor necrosis factorTRE: Transcriptional Response ElementTRPC3: canonical transient receptor potential protein 3WHO: World Health Organizationفهرست شکل ها و جداول:شکل 1 : نحوه عملکرد کلی FGF و FGFRشکل 2 : گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع 2شکل 3 : ساختمان کلی RTK و انواع FGFRشکل 4 : ساختمان اصلی یک اسید آمینهشکل 5 : ساختمان اول، دوم، سوم و چهارم پروتئینشکل 6 : دسته بندی گیرنده های تیروزین کینازیشکل 7 : ساختار فاکتورهای رشد فیبروبلاستشکل 8 : ساختار کریستالی کمپلکس FGF10-FGFR2bشکل 9 : ا گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی و نواحی فسفریله شدن آنشکل 10 : برخی از بیماریها و موتاسیون های نقطه ای پاتولوژیک گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستیشکل 11 : مسیر پیام رسانی گیرنده های فاکتور های رشد فیبروبلاستیشکل 12 : مسیر پیام رسانی Ras/MAPKشکل 13 : مسیر پیام رسانی  PLCy/Ca+2شکل 14: مسیر پیام رسانی  PI3-K/Aktشکل 15: مسیر سیگنالینگ ROSشکل 16: پروتئین کیناز فعال کننده میتوژنشکل 17 : مسیر فسفاتیدیل اینوزیتول-3 کینازشکل 18 : فاکتور رونویسی القاء شده 1شکل 19: مسیر سیگنالینگ NF-kBشکل 20 : فاکتور هسته ای فعال کننده سلول Tشکل 21: مسیر پیام رسانی AP-1شکل 22 : عملکرد رسپتور NMDAR و فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغزشکل 23: اثر کادمیوم بر مسیر سیگنالینگشکل 24: انواع مسیرهای سیگنالینگ MAPKشکل 25: اثر نیکل بر مسیر سیگنالینگشکل 26: آبشار سیگنالینگ فسفولیپیدشکل 27: ساختار شیمیایی اسیدآمینه های تیروزین ، تریپتوفان و فنیل آلانینشکل 28: دیاگرام جابلونسکیشکل 29: دناتوراسیون پروتئینشکل 30: ساختار شیمیایی اوره و گوانیدین هیدروکلرایدشکل 31: پروتئین های نوترکیب و مزایاشکل 32: استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئینشکل 33: توالی ژنی ناحیه کینازی و نقشه شماتیک از پلاسمید pLEICS-01شکل 34: شمای کلی از روش ترانسفورماسیونشکل 35: روش انجام SDS-PAGE به منظور بررسی بیان پروتئینشکل 36: تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبیشکل 37: اسپکتروفلوریمتری Cary مدل Bio700 (Spectrofluorimetry)شکل 38: اسپکتروسکوپی CD مدلJasco - J810  Circular dichroism spectroscopy))شکل 39: اسپکتروسکوپی FTIR مدل (Infrared spectroscopy) Perkin-Elmer Spectrum RXIشکل 40: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری E.coli در دمای 37 درجه سانتی گرادشکل 41: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری  E.coliدر دمای 20 درجه سانتی گرادشکل 42: مقایسه‏ی حلالیت ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در دو دمای20 و 37 درجه سانتی گرادشکل 43: خالص‏سازی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی حاوی Ni²+-NTAشکل 44: نتایج SDS-PAGE بعد از دیالیزشکل 45: بررسی عملکرد ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b خالص شدهشکل 46: بررسی اثر سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل، بر روی ساختار دوم ناحیه‏ی تیروزین  کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده از دستگاه CDشکل 47: بررسی تاثیر سرب بر پروتئین مورد نظر در دستگاه FTIRشکل 48: بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2bشکل 49: بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2bشکل 50: بررسی اثردناتوراسیون شیمیایی بر شدت نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2bجدول 1: جدول متغیرهاجدول2: خصوصیات فلوئورسنس اسیدآمینه های آروماتیکجدول 3: رنج نرمال و سمی فلزات سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل در مایعات بدن.فهرست مطالبفصل اول     مقدمه و اهمیت موضوع. 31-1- مقدمه 41-1-1- فاکتور رشد فیبروبلاستی. 41-1-2- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست.. 41-1-3- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست نوع 2. 51-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی تیروزین کینازی.. 61-1-5- فعال سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون. 81-2- اهمیت موضوع وضرورت انجام تحقیق. 91-3- اهداف طرح 91-3-1- هدف اصلی. 91-3-2- اهداف فرعی. 91-3-3- اهداف کاربردی.. 101-3-4- فرضیات.. 101-3-5- متغییرها 10فصل دوم      مروری بر متون گذشته. 112-1- پروتئین 122-1-1- ساختمان پروتئین ها 132-1-2- گیرنده های تیروزین کینازی.. 172-1-3- فاکتورهای رشد فیبروبلاستی. 182-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی. 202-1-5- گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی و اختلالات پاتولوژیکی. 222-1-6- مسیر پیام رسانی سلولی فاکتورهای رشد فیبروبلاستی. 252-1-7- تنظیم مسیر پیام رسانی فاکتور های رشد فیبروبلاستی. 292-2- فلز چیست؟ 312-2-1- فلزات سمی. 312-2-3- سرب.. 322-2-4-کادمیوم 322-2-5- نیکل. 332-2-6-آلومینیوم 332-7- تاثیر فلزات بر مسیرهای سیگنالینگ. 342-7-1-ROS. 342-7-2- MAPK.. 352-7-3- PI3K/Akt 362-7-4- HIF. 372-7-5- NF-kB.. 382-7-6- NFAT. 392-7-7- AP. 402-8- اثر ترکیبات فلزی بر مسیرهای سیگنالینگ و بیان ژن 412-8-1- سرب.. 412-8-2- کادمیوم 432-8-3- نیکل. 462-8-4- آلومینیوم 482-9- پیشگویی ساختمان پروتئین ها 502-9-1- بررسی ساختار پروتئین ها 502-9-2- مطالعه ی ساختاری پروتئین ها 512-9-3- تکنیک های مطالعه ی ساختار پروتئین  ها 522-9-4- تکنیک فلوئورسانس اسپکتروسکوپی. 532-9-5- تکنیک دورنگ نمایی حلقوی(CD) 562-9-6- تکنیک ها و عوامل دناتوراسیون. 572-10- تکنیک های تولید و تخلیص پروتئین های نوترکیب. 602-10-1- کاربرد پروتئین های نوترکیب. 602-10-2- پروتئین های نوترکیب (Recombinant proteins ) 602-10-3- تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان. 632-10-4- استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین. 642-10-5- خالص سازی پروتئین های نوترکیب.. 64فصل سوم   مواد و روش ها. 663-1- مواد، تجهیزات و متغیر ها ی آزمایش. 673-1-1- مواد مورد استفاده در آزمایش.. 673-1-2- دستگاه ها و تجهزات مورد استفاده در آزمایش.. 683-2- محلول ها و بافرها 693-2-1- تهیه ی استوک آمپی سیلین. 693-2-2- تهیه ی استوک IPTG.. 703-2-3- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت بررسی حلالیت پروتئین. 703-2-4- تهیه ی بافر لیز کننده  سلول جهت تخلیص پروتئین. 703-2-5- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 4%... 703-2-6- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 12%... 713-2-7- تهیه ی محلول  APS10%... 713-2-8- تهیه ی بافر الکترود x10  (Running buffer) 713-2-9- تهیه ی بافر نمونه Sample Buffer)) 713-2-10- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/0 مولار. 723-2-11- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/1 مولار. 723-2-12- تهیه ی Staining Buffer 723-2-13- تهیه ی Destaining Buffer 733-2-14- تهیه ی محلول آکریل آمید- بیس آکریل آمید 733-2-15- تهیه بافر SDS. 733-2-16- تهیه بافرA (Washing Buffer) 733-2-17- تهیه بافر B (   (Eluting Buffer 743-2-18- تهیه بافر دیالیز. 743-2-19- تهیه استوک گوانیدین هیدروکلراید (GnHCl) 743-2-20- تهیه استوک فلزات.. 743-2-21- آماده سازی محیط های کشت باکتری.. 743-3- روش انجام کار 753-3-1- نمایش ساختار پلاسمید نوترکیب pLEICS-01 و توالی ژنی ناحیه تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b. 753-3-2- مراحل تولید پروتئین نوترکیب.. 773-3-3- تعیین غلظت پروتئین. 833-3-4- مطالعات اسپکتروسکوپی فلوئورسانس.. 833-3-5- مطالعات اسپکتروسکوپی دورنگ نمایی حلقوی CD)) 853-3-6- مطالعات اسپکتروسکوپی FTIR.. 863-3-7- مطالعات دناتوراسیون شیمیایی با استفاده از اسپکتروسکوپی فلوئورسانس.. 87فصل چهارم یافته ها و نتایج.................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... 884-1- بررسی بیان پروتئین در دمای 37 درجه سانتی گراد 884-2- بررسی بیان پروتئین در دمای20 درجه سانتی گراد 894-3- بررسی  حلالیت پروتئین بیان شده دردو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد 904-4- بررسی میزان خلوص پروتئین محلول شده 914-5- آنالیز SDS-PAGE بعد از دیالیز 924-6- بررسی عملکرد پروتئین خالص شده 934-7- بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 944-8- بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 984-9- بررسی اثردناتوراسیون شیمیایی بر شدت نشر فلوئورسانس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 1014-10- بررسی اثر سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل، بر روی ساختار دوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 104فصل پنجم      بحث و نتیجه گیری.. 1095-1- بحث و نتیجه گیری. 110فهرست منابع: 116….………………………………………………………………………………..Abstract125

چکیدهزمینه: عوامل رشد فیبروبلاست (FGF) و گیرنده های آنها (FGFR) نقش اساسی در سلول ایفا می کنند. عدم تنظیم در مسیرهای سیگنالینگ FGF / FGFR با بسیاری از ناهنجاری ها و گسترش سرطان همراه است. از این گروه گیرنده‏ فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع دو در مسیر پیام‏رسانی سلولی و تنظیم فرآیندهای مهم زیستی از جمله تمایز و تکثیر سلولی نقش اساسی دارد. اختلال در انتقال پیام این گیرنده با چندین اختلال پاتولوژیکی انسانی مرتبط می باشد. در این میان مسمومیت با فلزات سمی نیز یکی از مشکلات عمده در زیست شناسی سلولی است که اثرات آنها بر مسیرهای مختلف سیگنالینگ به اثبات رسیده است.هدف: این مطالعه به منظور تخلیص ناحیه کینازی FGFR2b و بررسی اثر فلزات سمی سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بر ساختار ناحیه کینازی رسپتور فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع دو انجام شد.مواد و روش‏ها: در این مطالعه تجربی پروتئین نوترکیب با استفاده از پلاسمیدpLEICS-01 ، باکتری BL21، القائ IPTG ، الکتروفورز و ستون حاوی Ni2+ -NTA بیان و خالص شد. فعال بودن نمونه پروتئین بعد از دیالیز توسط تعامل با ناحیه SH2 فسفولیپاز(PLC)C طبیعی و موتان توسط روش PAGE بررسی شد. طیف فلوئورسانس، CD, FTIR و دناتوراسیون شیمیایی پروتئین خالص شده در حضور غلظت های مختلف سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بررسی و ارزیابی گردید.یافته‏ها: بررسی SDS-PAGE قبل و بعد از القا شدن نشان داد که پروتئین بیان شده در دمای 20 درجه سانتی گراد محلول است. نتایج PAGE فعال بودن پروتئین خالص شده را تأیید کرد. بررسی طیف سنجی فلوئورسانس کاهش شدت نشر را با افزایش تدریجی غلظت هر چهار فلز سمی نشان داد. طیف CD نشان داد ناحیه ی کینازی مورد مطالعه ما دارای ترکیب بتای بیشتری نسبت به آلفا می باشد و نیز حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم در محلول، ساختار دوم کیناز را تغییر نمی دهد، ولی سرب قادر به تغییر این ساختار می باشد. آزمایش انجام شده توسط FTIR نیز اثر سرب را تایید کرد. دناتوراسیون شیمیایی ساختار سوم در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم ناحیه کینازی را تغییر نداد. ولی این تغییر در حضور سرب مشاهده شد.بحث و نتیجه‏گیری: باتوجه به یافته ها، ناحیه‏ کینازی گیرنده‏ نوترکیب عامل رشد فیبروبلاستی 2b که یک پروتئین 38 کیلودالتونی است تولید و خالص گردید و نشان داده شد که به صورت محلول و فعال است. تغییرات ساختار سوم و دوم ناحیه کینازی موجب ناپایدار شدن آن در حضور سرب گردید. این ناپایداری در سطح مولکولی می تواند موجب اختلال در مسیر پیام رسانی سلول شود. گرچه این ناپایداری در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم مشاهده نشد.کلیدواژه‏ها: گیرنده‏ فاکتور رشد فیبروبلاستی، ناحیه کینازی، سیگنالینگ، فلزات سمی، طیف سنجی فلوئورسانس، CD،  FTIR

- مقدمه

1-1-1- فاکتور رشد فیبروبلاستی

فاکتور رشد فیبروبلاستی یا FGF (شکل 1) پروتئینی است که در بسیاری از فرآیندهای سلولی نظیر تقسیم سلولی، تکوین جنین، رگ زایی و بسیاری از فرآیندهای دیگر نقش دارد. به علاوه، این پروتئین به عنوان یک فاکتور مهم به محیط کشت سلولهای بنیادی جنینی انسانی اضافه می شود تا بتوان سلول ها را در حالت بنیادینگی و بدون تمایز حفظ و تکثیر کرد (1).

1-1-2- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست

گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست(FGFR)  در مسیر پیام رسانی سلول نقش کلیدی درتنظیم فرآیندهای زیستی از جمله تکثیر سلولی، بقا، مهاجرت و تمایز سلولی ایفا می کنند (2). متابولیسم سلولی، ترمیم بافتی، رگ زایی و توسعه ی مراحل جنینی از جمله وظایفی هستند که در دوران جنینی و بزرگسالی در بدن توسط این گیرنده ها با اتصال به فاکتورهای رشد فیبروبلاستی (FGF) انجام می شود(3). فرم های موتاسیون یافته ی گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی در سرطان های متعددی از جمله سرطان ریه، پستان، معده، مغز، سر و گردن، پروستات، کولون، رحم، مثانه و هم چنین مولتیپل میلوما شناخته شده است(6-4). عدم تعادل در انتقال پیام (سیگنالینک) FGFR با چندین اختلال پاتولوژیک انسانی مانند سندرم های اسکلتی مرتبط است (4). در این میان، FGFR2، نقش مهمی را در رشد و ترمیم بافتی بویژه استخوان و عروق خونی دارد.تعداد صفحه : 144قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید