دانلود پایان نامه : مطالعه اثر مایعات یونی بر پایداری و فعالیت هیدرولازی آنزیم لیپاز ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس

دانلود متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی

گرایش : علوم سلولی و مولکولی

عنوان : مطالعه اثر مایعات یونی بر پایداری و فعالیت هیدرولازی آنزیم لیپاز ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس

دانشگاه شیراز

دانشکده علوم

 

پایان­  نامه کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی(علوم سلولی و مولکولی)

 

مطالعه اثر مایعات یونی بر پایداری و فعالیت هیدرولازی آنزیم لیپاز ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس

 

 

استاد راهنما:

دکتر حمیدرضا کربلایی حیدری

 

دی ماه 1393

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکیده

مایعات یونی را می­توان به عنوان محیط واکنش­های بیوکاتالیز جایگزین­هایی سبز برای حلال­های آلی به شمار برد. ترکیبات مختلفی از کاتیون­ها و آنیون­ها را می­توان جهت دست­یابی به طیف وسیعی از مایعات یونی با ویژگی­های فیزیکی شیمیایی مختلف به کار برد. با توجه به گستره وسیع خصوصیات مایعات یونی، نیاز است که مایعات یونی مناسب برای هر آنزیم خاص و هر محیط واکنش خاص مشخص شود. آنزیم لیپاز ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس (TTL) یک لیپاز مقاوم به دما است که اختصاصیت انانتیومری خوبی نسبت به الکل­های ثانویه دارد. بنابراین از TTL می­توان به عنوان یک آنزیم بالقوه صنعتی، در انجام واکنش های تفکیک مخلوط­های راسمیک استفاده کرد. در این پژوهش فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL در حضور غلظت­های مختلف مایعات یونی [CnMIM][Br] (12، 6، 4، 2 = n) مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به این موضوع که پایداری دمایی آنزیم در محیط­های حاوی مایعات یونی یک شرط مهم برای استفاده از این محیط­ها در فرآیندهای صنعتی می­باشد، پایداری دمایی آنزیم از نظر سینتیکی و ساختاری در 10 نوع مایع یونی با کاتیون­ها و آنیون­های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج افزایش فعالیت هیدرولازی و پایداری دمایی آنزیم TTL در مایعات یونی نسبت به محیط بافری را نشان می­دهد. غلظت بهینه مایعات یونی [CnMIM][Br] در جهت افزایش فعالیت آنزیمی نیز به دست آمد. نتایج نشان داد که آنزیم TTL به ترتیب در غلظت های 3/0، 1 و 3/0 مولار از مایعات یونی [C2MIM][Br]، [C4MIM][Br] و [C6MIM][Br] بهترین فعالیت را داشته است. در حالی­که در مورد مایع یونی [C12MIM][Br] هیچ اثر مثبتی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم مشاهده نشد. همچنین مشخص گردید که نوع کاتیون و نوع آنیون مایعات یونی، شدت اثر آن­ها بر پایداری آنزیم TTL را تحت تأثیر قرار می­دهد. نوع آنیون به دلیل اندازه کوچک و چگالی بار بالایی که دارند، اهمیت بیشتری نسبت به نوع کاتیون دارد. در مقایسه­ای که بین مایعات یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][Br] در دماهای بالا (°C 85 و °C 90) انجام شد، مایع یونی دارای آنیون PF6 اثر پایدارکننده بیش­تری را برای آنزیم TTL ایجاد کرد. پایداری آنزیم در حضور مایعات یونی با طول زنجیره آلکیلی کوتاه و متوسط، مشابه بود. هرچند مایعات یونی با زنجیره کاتیونی طویل اثر منفی بر پایداری ساختار آنزیم می­گذارند. همچنین در این پژوهش نشان داده شد با تغییر نوع کاتیون از پایه ایمیدازولیوم به پایه پیریدینیوم تغییر زیادی در میزان پایداری دیده نمی­شود. مطالعات ساختاری پایداری دمایی آنزیم پس از حرارت­دهی در °C 85، با روش اسپکتروسکوپی فلورسانس نیز انجام شد. مطالعه فلورسانس ذاتی TTL نشان داد که در مایعات یونی با آنیون PF6 ساختار آنزیم تا حد زیادی حفظ می­شود؛ به طوری که تفاوت کمی بین شدت نشر فلورسانس قبل و بعد از 1 ساعت حرارت­دهی در °C 85 دیده می­شود. در مایعات یونی [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] بعد از 45 دقیقه آنزیم همچنان بیش از 50 % از فعالیت خود را حفظ کرد. این درحالی است که پایداری آنزیم در محیط آبی در دماهای بالاتر از °C 80 کمتر از 15 دقیقه است. با توجه به یافته های پژوهش حاضر، می توان از آنزیم TTL برای کاتالیز فرایند­های زیستی در مایعات یونی و دماهای بالا بهره برد.

کلمات کلیدی: مایعات یونی، لیپاز، ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس ، پایداری دمایی.

 

 

 

فهرست مطالب

 

 

عنوانصفحه
فصل اول: مقدمه

 

 
1-1- آنزیم­ها2
1-2- لیپازها3
1-2-1- ارتباط ساختار آنزیم لیپاز با عملکرد آن5
1-3- آنزیم­ها در محیط آلی6
1-4- مایعات یونی8
1-5- بیوکاتالیز در مایعات یونی9
1-5-1- آنزیم­ها در مخلوط­های مایع یونی – آب10
1-5-2- فعالیت آنزیم­ها در شرایط نسبتا بی­آب در مایعات یونی11
1-5-3- پایداری آنزیم­ها در مایعات یونی تقریبا بی­آب13
1-5-4- آنزیم­ها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت13
1-5-5- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپاز­ها و استرازها14
1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس15
فصل دوم: مروری بر پژوهش­های پیشین

 

 

 

2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز18
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم19
2-3- بررسی ساختار آنزیم­ها در مایعات یونی22
اهداف23
فرضیه23
فصل سوم: مواد و روش­ها

 

 

 

3-1- ابزار25
 

عنوان

صفحه
3-2- مواد26
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی26
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL26
3-2-2-1- سوش باکتری26
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون26
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی26
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز26
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE27
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز27
3-2-4- نرم افزارها27
3-3- روش­ها28
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی28
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید28
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات28
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب29
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli29
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli29
3-3-2-2-1-  تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی29
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد30
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری31
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب31
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب31
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL31
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا32
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL32
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL33
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی33
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی33
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی33
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین34
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد34
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 28034
 

عنوان

صفحه
3-3-5- الکتروفورز ژل پلی­آکریل آمید با SDS (SDS-PAGE)35
3-3-5-1- آماده سازی محلول­های الکتروفور35
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورز36
3-3-6- سنجش فعالیت آنزیمی با سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات38
3-3-7- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی39
3-3-8- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا39
3-3-9- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف39
3-3-10- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی40
فصل چهارم: نتایج

 

 

 

4-1- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب42
4-1-1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL43
4-1-2- بهینه سازی زمان پس از القا43
4-2- تخلیص آنزیم لیپاز TTL44
4-2-1- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی44
4-2-2- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز45
4-3- سنتز مایعات یونی47
4-4- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL47
4-5- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL48
4-5-1- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی48
4-5-2- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی49
4-5-2-1- بررسی پایداری TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهای مختلف49
4-5-2-2- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی51
4-5-2-3- مقایسه اثر نوع کاتیون و طول­های مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم51
4-6- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی54
فصل پنجم: بحث

 

 

 

5-1- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL57
 

عنوان

صفحه
5-2- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL59
5-3- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی61
فصل ششم: نتیجه­گیری و پیشنهادات

 

 

 

6-1- نتیجه­گیری63
6-2- پیشنهادات63
فهرست منابع65
چکیده انگلیسی75

فهرست جدول­ها

 

 

عنوان

 

صفحه

 

جدول1-1- میکروارگانیسم­های تولید کننده لیپاز4
جدول2-1- آنیون­های متداول در مایعات یونی19
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani29
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSB30
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCM31
جدول 3-4- نحوه تهیه محلول برادفورد34
جدول 3-5-  نحوه تهیه بافر نمونه 4X37
جدول 3-6- نحوه تهیه ژل پلی اکریل آمید37
جدول 3-7- نحوه تهیه مخلوط سنجش فعالیت آنزیم38
جدول 4-1- فعالیت­های لیپازی عصاره­های سلولی کلنی­های 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسیون44
جدول 4-2- مشخصات مراحل تخلیص TTL.46
جدول 5-1- غلظت­های بهینه مایعات یونی (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه58

فهرست شکل­ها

 

 

عنوان

 

صفحه

 

شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL)6
شکل 1-2- آنیون­ها و کاتیون­های مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز9
شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب12
شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی معمول در بیوکاتالیز18
شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید28
شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوی ژن آنزیم TTL42
شکل 4-2- بهینه سازی مدت زمان تخلیص به روش رسوب دهی دمایی45
شکل 4-3- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخلیص آنزیم TTL46
شکل 4-4- تصویر ژل SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخلیص آنزیم TTL47
شکل 4-5- اثر غلظت­های مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی48
شکل 4-6- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 5049
شکل4-7- نمودار پایداری TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهای °C 85 و °C9050
شکل4-8- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون52
شکل 4-9-  نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طول­های مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم بر پایداری دمایی آنزیم TTL53
شکل 4-10- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL53
شکل 4-11- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارت­دهی در °C 8554
شکل 4-12- طیف­های فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF655
شکل 4-13- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C4MIM][PF6]55

مقدمه

 

 

1-1- آنزیم­ها

آنزیم ها کاتالیزورهای زیستی بسیار کارآ هستند که می­توانند سرعت واکنش­ها را تا 17 برابر افزایش دهند(Agarwal, 2006). بخشی از زیست توده[1] زمین لیپیدها هستند و آنزیم­های لیپولیتیک[2] نقش مهمی در حذف این مواد نامحلول در آب را دارند. آنزیم­های لیپولیتیک در شکستن و حرکت دادن لیپیدها درون سلول­های یک جاندار و انتقال لیپیدها از یک جاندار به جاندار دیگر نقش دارند (Beisson et al., 2000).

آنزیم­ها مزایای زیادی در انجام واکنش­ها دارند که از جمله آن­ها می­توان اختصاصیت بالای آن­ها، انجام واکنش در شرایط معتدل، کاهش مواد زائد، تعیین نوع محصول و کاهش محصولات جانبی با انتخاب آنزیم مناسب، کاهش هزینه­ها و سرمایه لازم در مقیاس بزرگ، کاهش اتلاف هزینه در فرآیندهای آنزیمی، زیست تخریب پذیر بودن آنزیم­ها، کاهش میزان مصرف کاتالیزور (آنزیم) به میزان 1%- 1/0% سوبسترا را نام برد؛ بنابراین سهم آنزیم در[3]BOD جریان مواد زائد بسیار ناچیز است (Posorske et al., 1984).

آنزیم­های میکروبی کارآتر از انواع گیاهی و جانوری هستند. آنزیم­های میکروبی دارای تنوع عملکردی بالا، بازده بالا، دست­ورزی ژنتیکی آسان، منبع مشخص (که این به دلیل نبود نوسانات فصلی، رشد سریع باکتری و محیط رشد ارزان قیمت آن می­باشد)، پایداری بیش­تر و تولید آسان­تر نسبت به انواع گیاهی و جانوری هستند (Wiseman et al., 1995). رشد سریع باکتری­ها و بنابراین آسان­تر بودن فرآیندهای غربالگری در مورد آن­ها، باعث تسهیل فرآیندهایی هم­چون دست ورزی ژنتیکی و ایجاد تغییرات در محیط اطراف سلول، در جهت دست­یابی به بیش­ترین تولید آنزیم، افزایش فعالیت آنزیمی سلول­ها، ایجاد روند تولید پیوسته یا تولید القایی می­شوند. تنها حدود دو درصد از گونه­های میکروبی به عنوان منبع آنزیم بررسی شده­اند که در این میان سویه های باکتریایی به دلیل فعالیت بالاتر، pH بهینه خنثی یا قلیایی و مقاومت به دما، بیش­تر از مخمرها مورد استفاده قرار گرفته­اند (Frost and Moss, 1987).

 

تعداد صفحه : 94

قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09199970560        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

شماره کارت :  6037997263131360 بانک ملی به نام محمد علی رودسرابی

11

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید