پایان نامه ارشد:بررسی ارزش تشخیصی روش های بیوشیمیایی (ADA و IFN-γ) و میکروبی برای تشخیص سل در نمونه ی پلور بیماران مبتلا به سل فعال پلور در شهر تهران

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

گرایش :بیوشیمی

عنوان : بررسی ارزش تشخیصی روش های بیوشیمیایی (ADA و IFN-γ) و میکروبی برای تشخیص سل در نمونه ی پلور بیماران مبتلا به سل فعال پلور در شهر تهران

دانشگاه آزاد اسلامی

 واحد دامغان

 دانشکده علوم پایه

پایان نامه کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی

 گرایش بیوشیمی

عنوان:

بررسی ارزش تشخیصی روش های بیوشیمیایی (ADA و IFN-γ) و میکروبی برای تشخیص سل در نمونه ی پلور بیماران مبتلا به سل فعال پلور در شهر تهران

 

استاد راهنما:

دکتر سعید ذاکر بستان آباد

استاد مشاور:

دکتر سکینه سعیدی سار

دی ماه 1393

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)فهرست مطالبچکیده 1فصل اول- کلیات... 31-1 تاریخچه ی بیماری سل.. 31-2 عامل بیماری زا - مایکوباکتری.. 41-2-1 مایکوباکتریوم توبرکلوزیس... 51-2-2 اجزای  تشکیل دهنده ی دیواره ی سلولی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس... 51-3 بیماری زایی.. 61-3-1 فاکتور طنابی.. 71-4 انتقال باسیل سل به انسان. 71-5 روند بیماری سل.. 81-6 واکنش ایمنی نسبت به سل.. 91-6-1 تماس و عفونت اولیه. 91-6-2 ظهور کانون ثانویه. 131-7 انواع سل.. 141-7-1 سل ریوی.. 141-7-2 سل خارج ریوی.. 151-7-2-1 سل پلور. 151-7-2-2 تظاهرات بالینی ناشی از سل پلور. 161-8 روش های تشخیصی بیماری سل.. 171-8-1 روش میکروسکوپی-رنگ آمیزی زیل نلسن.. 171-8-2 کشت... 191-8-2-1 محیط کشت  لوون اشتاین جنسن.. 191-8-2-2 خصوصیات رشد. 201-9 تشخیص سل پلور. 211-9-1 سنجش اینترفرون گاما 211-9-1-1  تکنیک الایزا 231-9-1-2 وسایل و تجهیزات مورد نیاز در روش الایزا 231-9-1-3 روش الایزا ی ساندویچ.. 251-9-2 آنزیم آدنوزین دی آمیناز. 261-9-2-1 ویژگی های آدنوزین دآمیناز. 261-9-2-2 متابولیسم آدنوزین دآمیناز. 271-9-2-3 سنجش فعالیت آدنوزین دآمیناز. 281-10 هدف از انجام مطالعه. 28فصل دوم- مروری بر سوابق تحقیق.. 292-1 سوابق تحقیق.. 29فصل سوم- روش انجام کار. 353-1 اقدامات ایمنی.. 353-2 جمع آوری و انتقال نمونه. 363-3 آماده سازی نمونه. 383-3-1 آلودگی زدائی.. 383-3-1-1 هضم و آلودگی زدائی به روش پتروف... 393-3-2 خنثی سازی.. 403-4 تهیه ی گسترش از نمونه ی مایع پلور. 413-5 رنگ آمیزی.. 413-5-1 رنگ امیزی زیل نلسن.. 423-5-1-1 ساخت رنگ فوشین.. 423-5-1-2 مرحله ی رنگ بری-ساخت محلول رنگ بر. 433-5-1-3 رنگ زمینه. 443-6 بررسی و گزارش نتیجه ی لام. 453-7 کشت... 493-7-1 روش ساخت محیط کشت لوون اشتاین جنسن.. 493-7-1-1 مخلوط یکنواخت تخم مرغ. 493-7-1-2 محلول نمکی.. 503-7-1-3 محلول مالاشیت گرین.. 503-7-2 منعقد نمودن محیط.. 523-8  انجام کشت نمونه ی مایع پلور. 533-9 بررسی و جوابدهی نتیجه ی کشت... 573-9-1 جدول زمانی بررسی کشت... 573-9-2 بررسی منظره ی ماکروسکوپی کشت... 573-9-3 خواندن کشت و ثبت نتایج.. 583-10 اندازه گیری غلظت اینترفرون گاما در نمونه ی پلور بیماران. 583-10-1 اجزای موجود در کیت الایزا 593-10-2 نمونه های مناسب جهت بررسی.. 603-10-3 رقیق سازی محلول استاندارد. 603-10-4 روش کار-تلقیح نمونه. 623-10-5 اساس تست... 623-10-6 مراحل انجام تست... 643-10-6-1 چاهک بلانک... 643-10-6-2 چاهک های استاندارد. 643-10-6-3 چاهک های نمونه. 643-10-6-4 تهیه ی محلول شستشو. 643-10-6-5 شستشو. 643-10-6-6 ایجاد رنگ... 653-10-6-7 توقف واکنش... 653-10-7  فرایند اندازه گیری.. 663-11 تعیین میزان فعالیت آنزیم آدنوزین دی آمیناز. 663-11-1 اجزای تشکیل دهنده ی کیت آدنوزین دآمیناز. 663-11-2 اساس واکنش... 683-11-3 اتوآنالایزر. 693-11-3-1 قسمت های تشکیل دهنده ی دستگاه اتوآنالایزر. 703-11-3-2 رویه ی تست برای دستگاه هیتاچی.. 733-11-4 محدودیت ها در طی فرایند اندازه گیری.. 733-11-5 خواندن نتایج.. 73فصل چهارم- یافته ها و نتایج.. 744-1 نتایج مطالعه ی میکروسکوپی.. 754-2 نتایج کشت... 754-3 نتایج تست الایزا جهت سنجش غلظت اینترفرون گاما 764-4 نتایج حاصل از بررسی فعالیت آدنوزین دآمیناز. 80فصل پنجم- بحث و جمع بندی.. 855-1 بحث... 855-2 جمع بندی.. 915-3 پیشنهادات... 93چکیده انگلیسی.. 101 فهرست شکلشکل 1-1 ساختمان دیواره ی سلولی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس   ................................................................  6شکل 1-2 کنترل تکثیر مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در بافت ریه  .................................................................  11شکل 1-3 تشکیل گرانولوما در پی عفونت اولیه با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ............................................  11شکل 1-4 محل ضایعه ی اولیه، ضایعات گرانولوماتوز در بافت ریه  ...........................................................  12شکل 1-5 نمایش حفره ی سلی در بافت ریه  ..............................................................................................  13شکل 1-6 نمایش کلی از آسیب زائی در عفونت با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس  ........................................... 14شکل 1-7 رادیوگراف قفسه ی سینه در بیمار آلوده به سل جنبی ..................................................................  16شکل 1-8 نمایش بافت ریه، جنب و تراوش جنبی ناشی از سل ...................................................................  17شکل 1-9 باسیل های اسید فست در نمونه ی خلط پس از رنگ آمیزی زیل نلسن ....................................... 18شکل 1-10 محیط کشت لوون اشتاین جنسن  ............................................................................................... 20شکل 1-11 کلونی های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس بر روی محیط کشت لوون اشتاین جنسن ..................... 21شکل 1-12 تصویری شماتیک از اساس تست الایزای ساندویچ .................................................................... 25شکل 1-13 آنزیم آدنوزین دآمیناز و دِآمینه شدن آدنوزین به اینوزین ............................................................. 26شکل 3-1 هود کلاس 2 .................................................................................................................................. 36شکل 3-2 چگونگی خارج نمودن مایع جنب از بیمار .................................................................................... 37شکل 3-3 نمونه ی مایع پلور  ........................................................................................................................ 38شکل 3-4 کاغذ pHسنج ................................................................................................................................. 40شکل 3-5 مرحله ی اول رنگ آمیزی زیل نلسن ............................................................................................ 43شکل 3-6 مرحله ی دوم رنگ آمیزی زیل نلسن ...........................................................................................  44شکل 3-7 مرحله ی آخر رنگ آمیزی زیل نلسن  .......................................................................................... 45شکل 3-8 نمونه ی لام رنگ آمیزی شده به روش زیل نلسن از نمونه ی مایع پلور .....................................  46شکل 3-9 تصویر رنگ آمیزی شده ی باسیل سل  ......................................................................................... 47شکل 3-10 معادل سازی ابعاد گستره با تعداد میدان میکروسکوپی قابل بررسی ...........................................  48شکل 3-11 مراحل ساخت مخلوط یکنواخت تخم مرغ برای ساخت محیط لوون اشتاین جنسن ................  49شکل 3-12 مواد مورد استفاده جهت ساخت محلول نمکی ..........................................................................  50شکل 3-13 محلول مالاشیت گرین  ..............................................................................................................  51شکل 3-14 مراحل ساخت محیط لوون اشتاین جنسن ..................................................................................  52شکل 3-15 منعقد نمودن محیط ها در دستگاه منعقد کننده ...........................................................................  53شکل 3-16 قرار گرفتن محیط های کشت به صورت مورب در انکوباتور ....................................................  54شکل 3-17 ظروف مخصوص اتوکلاو و حاوی ضایعات آلوده ی بخش مایکوباکتریولوژی ........................  55شکل 3-18 فلوچارت مراحل تهیه ی اسمیر و کشت از نمونه ی مایع پلور .................................................  56شکل 3-19 تصویر کلونی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در محیط لوون اشتاین جنسن ..................................  57شکل 3-20 تصویر کیت الایزا برای سنجش اینترفرون گامای انسانی ...........................................................  60شکل 3-21 رقیق سازی محلول استاندارد .....................................................................................................  61شکل 3-22 جداسازی نمونه های مایع پلور در میکروتیوب های استریل .....................................................  62شکل 3-23 اساس تست الایزای ساندویچ ....................................................................................................  63شکل 3-24 تلقیح نمونه و معرف های کیت در چاهک های الایزا  ..............................................................  65شکل 3-25 کیت تجاری Diazyme® جهت اندازه گیری فعالیت آنزیم ADA ............................................  67شکل 3-26 واکنش انجام شده در اندازه گیری ADA ...................................................................................  69شکل 3-27 دستگاه اتوآنالایزر هیتاچی ..........................................................................................................  70شکل 3-28 مراحل Set up کردن دستگاه هیتاچی ................................................................................. 71 و 72شکل 3-29 فرآیند انجام اندازه گیری ADA .................................................................................................  73نمودار 4-1 منحنی استاندارد بر اساس غلظت اینترفرون گاما و جذب نوری محلولهای استاندارد ...............  77فهرست جداولجدول 1-1 بیماریزایی مایکوباکتریوم ها در میزبان های مختلف .....................................................................  7جدول 3-1 خلاصه ای از الزامات سطوح ایمنی ............................................................................................. 35جدول 3-2 روش خواندن اسمیرهای رنگ آمیزی شده .................................................................................  48جدول 3-3 چگونگی خواندن و گزارش نتایج کشت  ...................................................................................  58جدول 3-4 اجزای موجود در کیت الایزا  .....................................................................................................  59جدول 3-5 دستورالعمل ساخت محلول های استاندارد در کیت الایزا  .........................................................  61جدول 3-6 اجزای تشکیل دهنده ی معرف 1 در کیت Diazyme®  ............................................................  67جدول 3-7 اجزای تشکیل دهنده ی معرف 2 در کیت Diazyme®  ............................................................  68جدول 4-1 اطلاعات فردی مربوط به بیماران ................................................................................................  75جدول 4-2 اطلاعات مربوط به غلظت و جذب نوری محلول های استاندارد تکنیک الایزا ..........................  76جدول 4-3 میزان جذب نوری و غلظت IFN-γ محاسبه شده در نمونه ی مایع پلور بیماران .......................  77جدول 4-4 محاسبه ی میانگین و انحراف از معیار جامعه بر اساس غلظت IFN-γ ......................................  79جدول 4-5 مقایسه ی جامعه ی پلورزی سلی و جامعه ی مورد مطالعه ی ما از نظر غلظت IFN-γ ............  79جدول 4-6 مقایسه ی گروه پلورزی بدخیم و جامعه ی مورد مطالعه از نظر غلظت IFN-γ  .......................  80جدول 4-7 مقایسه ی متوسط غلظت IFN-γ در گروه غیر سل غیر بدخیم با گروه مورد مطالعه .................  80جدول 4-8 میزان فعالیت ADA در مایع پلور بیماران ...................................................................................  80جدول 4-9 مشاهده ی میانگین و انحراف از معیار فعالیت ADA در گروه مورد مطالعه ..............................  82جدول 4-10 مقایسه متوسط فعالیت ADA عفونت های غیر توبرکلوزیسی..................................................  82جدول 4-11 مقایسه ی متوسط فعالیت ADA در جمعیت مورد مطالعه و گروه بدخیمی .............................. 83جدول 4-12 مقایسه ی گوه مورد مطالعه و پلورال افیوژن سلی از لحاظ متوسط فعالیت ADA .................... 83

چکیده

سل یکی از کهن ترین بیماری های شناخته شده در انسان است که یک عامل عمده ی مرگ و میر در سراسر دنیا به شمار می رود. طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی در سال 2012 میلادی، حدود 8/8 میلیون نفر جدید به این بیماری مبتلا شده و حدود 1/1 میلیون نفر در اثر این بیماری جان سپردند. این بیماری ناشی از یک باکتری متعلق به مجموعه ی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس [1] است که نوعاً ریه ها را درگیر می کند. معمولاً سل به 2 گروه ریوی و خارج ریوی تقسیم می شود. از آنجائیکه تشخیص سل در فضای جنب به خودی خود بسیار دشوار است و نیز با توجه به اینکه تست های روتین مثل اسمیر، کشت و PCR حساسیت و اختصاصیت کافی در تشخیص سل و پلورال افیوژن ناشی از آن ندارند، از میان انواع سل خارج ریوی این مطالعه با تمرکز بر بررسی روش های تشخیصی سریع تر و اختصاصی تر سل پلور انجام گردید و نمونه ی مایع پلور 45 بیمار که با علائم بالینی مشکوک به سل پلور از فروردین تا آبان ماه سال 1393 به آزمایشگاه های سطح شهر تهران مراجعه نموده بودند، مورد ارزیابی قرار گرفت. از میان روش هایی که امروزه به نظر می رسد بتوان از آنها جهت تشخیص سریعتر سل پلور استفاده نمود، اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم آدنوزین دآمیناز و نیز سایتوکاین هایی نظیر اینتر فرون گاما است که از مهمترین تنظیم کننده های سیستم ایمنی به شمار می آید. بررسی های میکروبی بر روی نمونه ی مایع پلور شامل تهیه ی اسمیر و کشت انجام شد. اندازه گیری اینترفرون گاما در مایع پلور به روش الایزا انجام گردید. جهت سنجش میزان فعالیت آنزیم آدنوزین دآمیناز، سوبسترای آدنوزین تحت اثر آنزیمADA  به آمونیاک و اینوزین تبدیل شده و آمونیاک حاصل با روش رنگ سنجی اندازه گیری شد. از مجموع آنالیزهای انجام شده این طور به نظر می رسد که می توان بالا بودن فعالیت کل ADA را به عنوان یک تست غربالگری در تشخیص پلورال افیوژن سلی از سایر علل پلورال افیوژن دانست؛ اما نمی تواند جایگزین روش استاندارد طلایی (کشت) باشد. از طرف دیگر تیتر اینترفرون گاما با وجود افزایشی که در سل پلور نشان می دهد، می تواند در موارد دیگری به غیر از سل مانند انواع التهاب ها به دلیل تماس بدن با آنتی ژن های باکتری افزایش یابد و لذا نمی توان به طور اختصاصی بالا بودن غلظت اینترفرون گاما را دلیل قطعی بر عفونت با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس دانست.واژگان کلیدی: آدنوزین دآمیناز، اینترفرون گاما، مایع پلور،سل

فصل اول

کلیات

1-1 تاریخچه ی بیماری سل

بیماری سل می تواند به شکل های متفاوتی ظاهر شود و حتی استخوان ها را مورد حمله قرار داده و باعث تغییر شکل در استخوان ها گردد. بافت های سخت مانند استخوان ها می توانند باکتری ها را برای هزاران سال در خود حفظ کنند، به طوری که باکتری عامل بیماری سل را می توان در اجساد انسان هایی که در بیش از 4000 سال پیش در اثر سل استخوانی مرده اند، یافت. فراوانی اسکلت های کشف شده با ظاهر استخوان های تغییر شکل یافته ی سلی در مصر قدیم، نشان می دهد که این بیماری در جمعیت آن زمان مصر شایع بوده است. همچنین کشف استخوان های تغییر شکل یافته ی مشابه، متعلق به دوران نوسنگی در مناطق مختلف در کشورهای ایتالیا، دانمارک و نیز کشورهایی در خاورمیانه نشان می دهد که توبرکلوزیس از هزاران سال پیش در سرتاسر دنیا وجود داشته است (Daniel, 2006).منشاء مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل ایجاد سل، موضوع بسیاری از بررسی های اخیر بوده است و چنین استنباط می شود که باکتری های موجود در جنس مایکوباکتریوم مانند سایر اکتتینومیست ها ابتدا در خاک وجود داشته اند و سپس برخی از گونه ها خود را با زندگی در پستانداران تطبیق داده اند. احتمالاً اهلی کردن احشام که بین ده هزار تا بیست و پنج هزار سال پیش صورت گرفته است، باعث شده مایکوباکتریوم های بیماریزا از طریق دام های اهلی شده به انسان منتقل شده که در این تطابق با میزبان جدید، باکتری جدید به وجود آمده که بسیار شبیه به مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و دارای ارتباط بسیار نزدیکی با آن بوده است و این گونه تصور می شود که مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در طی یک جریان یا فرایند تکاملی از مایکوباکتریوم بوویس [2] که باعث ایجاد یک بیماری مشابه سل در احشام می گردد، به وجود آمده است. این فرضیه در حال حاضر به خاطر داده های جدید مورد تردید قرار گرفته است (Marais & Zumla, 2013).در نوشته های به ثبت رسیده در لوح های گلی آشوری ها در قرن هفتم پیش از میلاد، بیمارانی با سرفه های خونی توصیف شده اند و بقراط در قرن پنجم قبل از میلاد علائم بالینی بیماران با مرض سل (واژه ی یونانی آن Phthisis است) را به صورت سل ریوی، فساد بافت ها، ضعف و لاغری مفرط همراه با درد قفسه ی سینه و سرفه که در اغلب موارد وجود خون در خلط را به همراه دارد توصیف کرده است. فراوانی وقوع و توصیف علائم شبیه به سل تا این زمان نشان می دهد که بیماری در آن دوران شیوع فراوانی داشته است (Restrepo & Schlesinger, 2014).تصور می شود که احتمالاً بیماری سل از طریق مهاجرت چوپانان گله های گاوهای هندو-اروپایی که با گاوهای آلوده به این باسیل در تماس بوده اند، به دیگر مناطق حمل و انتقال داده شده است (Daniel, 2006; Restrepo & Schlesinger, 2014).در اواخر نیمه ی قرن نوزدهم، مرگ ومیر ناشی از سل کاهش یافت و این موضوع به طور وسیعی ناشی از رعایت اصول بهداشتی و خانه سازی بوده است. سپس با مهاجرت اروپاییان به دنیای جدید، این بیماری به امریکا نیز وارد شد؛ لیکن میزان مرگ و میر هرگز به سطح آنچه که در اروپا رسیده بود نرسید. کاهش میزان ناتوانی و مرگ ومیر ناشی از سل در خلال قرن بیستم در کشورهای پیشرفته به دلیل آموزش های بهداشت عمومی، استفاده ی گسترده از واکسن BCG  تهیه شده از سویه ی ضعیف شده ی مایکوباکتریوم بوویس و همچنین گسترش و توسعه ی آنتی بیوتیک ها در دهه ی 1950 بوده است (Mandal, 2013). دوره ی آنتی بیوتیک ها در رابطه با بیماری سل توسط کشف استرپتومایسین به وسیله ی شواتز و واکسمن در دهه ی 1940 شروع شد و در درمان بیماری سل مورد استفاده قرار گرفت، که این روند با تولید آنتی بیوتیک های زیاد دیگری مثل ایزونیازید، ریفامپین و پیرازین آمید که در مقابل بیماری سل مؤثر هستند ادامه یافت، ولی نتوانست بیماری را ریشه کن کند(WHO, 2010). علاوه بر آن استفاده ی گسترده از BCG که یک واکسن سویه ی ضعیف شده ی مایکوباکتریوم بوویس بیماریزاست که توسط کالمت و گورین در دهه ی 1920 در پاریس تولید شده بود، نتوانست میزان بروز بیماری سل را در سال های اخیر کاهش دهد و امروزه موارد سل بیش از دوره ها ی قبل است. (Lienhardt, Vernon, & Raviglione, 2010; Yew, Lange, & Leung, 2011)تعداد صفحه : 80قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید