پایان نامه ارشد:بررسی مقایسه­ای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم ­توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم ­بوویس به روش SDS-PAGE

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته : زیست شناسی

گرایش :میکروبیولوژی

عنوان : بررسی مقایسه­ای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم ­توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم ­بوویس به روش  SDS-PAGE

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد علوم و تحقیقات

 

پایان نامه کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی-میکروبیولوژی (M.Sc)

عنوان

بررسی مقایسه­ای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم ­توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم ­بوویس به روش  SDS-PAGE

استاد راهنما

دکتر احمد رضا بهرمند

 

مشاور

دکتر مهناز سیفی

 

سال تحصیلی 1392

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است) 
فهرست مطالب 
چکیده1
فصل اول- مقدمه3
1-1. کلیات سل4
1-2. بیان مسئله5
1-3. اهمیت و ضرورت7
1-4. اهداف8
فصل دوم- پیشینه تحقیق9
2-1. تاریخچه10
2-2. مایکوباکتریوم­ها11
2-3. طبقه­بندی مایکو باکتریوم­ها12
2-3-1. فتو کروموژن13
2-3-2. اسکوتوکروموژن13
2-3-3. غیر کروموژن14
2-3-4. سریع الرشد14
2-4. باکتریولوژی سل14
2-5. مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی15
2-6. خصوصیات رشد16
2-7 . فیزیولوژی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس17
2-7-1. انتقال مواد غذایی توسط غشاء خارجی18
2-7-2. انتقال توسط غشاء داخلی18
2-7-2-1. انتقال ترکیبات حاوی کربن18
2-7-2-2. انتقال ترکیبات غیر کربن19
2-8. فاکتورهای ویرولانس20
1-9. دیواره سلولی21
2-10. بیوشیمی دیواره سلولی23
2-11. بیماری­زایی23
2-11-1. مکانیسم بیماری­زایی25
2-12. درمان سل26
2-12-1. درمان سل حساس به دارو26
2-12-2. درمان سل مقاوم به دارو26
2-13. مقاومت دارویی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس27
2-14. مکانیسم مولکولی مقاومت دارویی28
2-14-1. مقاومت به ریفامپین28
2-14-2. مقاومت به ایزونیازید29
2-14-3. مقاومت به پیرازین آمید29
2-14-4. مقاومت به اتامبوتول30
2-14-5. مقاومت به استرپتومایسین30
2-14-6. فلورو کینولون­ها30
2-14-7. آمینوگلیکوزیدها31
2-14-8. سیکلوسرین31
2-14-9. پاراآمینوسالیسیلیک32
2-15. انواع سل33
2-15-1. سل ریوی33
2-15-2. سل خارج ریوی33
2-15-2-1. سل عقده­های لنفاوی33
2-15-2-2. سل پلور34
2-15-2-3. سل استخوانی34
2-15-2-4. سل سیستم عصبی مرکزی34
2-15-2-5. سل شکمی34
2-15-2-6. سل دستگاه تناسلی35
2-15-2-7. سل پریکاردیت35
2-15-2-8. سل ارزنی35
2-16. سل در کودکان36
2-17. سل و ایدز36
2-18. روش­های تشخیص سل37
2-18-1. تست پوستی37
2-18-2. کشت37
2-18-3. تهیه اسمیر38
2-18-4. تکنیک PCR38
2-18-5. بررسی اینترفرون گاما38
2-18-6. رادیوگرافی ریه39
2-19. اپیدمیولوژی39
2-19-1. وضعیت بیماری سل انسانی در ایران41
2-20. مایکوباکتریوم بوویس44
2-20-1. اهمیت سل گاوی45
2-21. مایکوباکتریوم بوویس ب.­ث.­ژ45
2-21-1. فیلوژنی45
2-21-2. تاریخچه BCG48
2-21-3. تاریخچه تولید و مصرف واکسن ب.ث.ژ در ایران50
2-21-4. ایمنی­زایی51
2-21-5. لزوم طراحی واکسن جدید52
2-22. پروتئومیکس مایکوباکتریوم­ها53
2-23. پیشینه تحقیق پروتئومیکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و بوویس58
فصل سوم- مواد و روش­ها61
3-1. نمونه­گیری63
3-2. کشت و جداسازی باکتری64
3-2-1. مواد مورد نیاز برای تولید محیط لوون اشتاین جانسون به میزان 5/1 لیتر64
3-2-2. طرز تهیه محیط کشت64
3-2-3. آلودگی­زدایی و تغلیظ نمونه­ها65
3-2-3-1. آماده سازی محلول­ها66
3-2-4. روش کار کشت66
3-2-4-1. محیط کشت حاوی تیوفن 2- کربوکسیلیک اسید هیدرازید67
3-3. تشخیص میکروسکوپی مایکوباکتریوم­ها67
3-3-1. تهیه گستره67
3-3-2. رنگ­آمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O68
3-3-3. رنگ­آمیزی ذیل-­ نلسون69
3-3-4. رنگ­آمیزی کینون (رنگ­آمیزی سرد)70
3-3-5. بررسی و آزمایش گسترش71
3-4. بررسی لوله­های کشت71
3-5. شناسایی و تعیین­ هویت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و بوویس72
3-5-1. تست نیاسین77
2-5-1-1. معرف­ها و مواد لازم تست نیاسین72
3-5-1-2. آماده­سازی محلولها ی نیاسین72
3-5-1-3. مراحل کارتست نیاسین73
3-5-2. آزمون­های احیای نیترات73
3-5-2-1. معرف­ها و مواد لازم تست نیترات73
3-5-2-2. آماده­سازی معرف­های تست نیترات74
3-5-2-3. مراحل انجام کار تست نیترات74
3-5-2-4. استاندارد­های احیاء نیترات74
3-5-3. تست کاتالاز75
3-5-3-1. محیط و مواد مورد نیاز76
3-5-3-2. آماده­سازی محلولهای تست کاتالاز76
3-5-3-3. مراحل انجام آزمایش روش نیمه کمی کاتالاز و کاتالاز 68 درجه76
3-5-3-4. نتایج و تفسیر آزمایش کاتالاز77
3-5-4. حساسیت به تیوفن 2- کربوکسیلیک هیدرازید (TCH)77
3-6. آزمایشات حساسیت داروئی در مایکوباکتریوم­ها77
3-6-1. تهیه محلول استاندارد مک فارلند78
3-6-2. تهیه سوسپانسیون باکتری78
3-7. کشت سویه­های انتخابی در محیط میدل بروک 7H978
3-7-1. مواد مورد نیاز78
3-7-1-1. آماده­سازی محیط78
3-7-1-2. انتحاب سویه­ها و کشت80
3-8. جمع­آوری سویه­ها میکروبی، استخراج و خالص­سازی پروتئین80
3-8-1. استخراج پروتئین­های غشایی80
3-8-1-1. مواد مورد نیاز80
3-8-1-2. تهیه بافر و محلول­ها80
3-8-1-3. روش کار81
3-8-1-4. استخراج پروتئین­های ترشحی81
3-8-2. خالص­سازی پروتئین81
3-8-2-1. مواد مورد نیاز81
3-8-2-1-1. آماده­سازی محلول­ها و مواد81
3-8-2-1-2. روش کار ترسب پروتئین­های غشایی83
3-8-2-1-3. ترسیب پروتئین­های ترشحی83
3-8-2-2. تعیین غلظت پروتئین­ها84
3-8-2-2-1.  مواد مورد نیاز84
3-8-2-2-2. آماده­سازی محلول­ برادفورد85
3-8-2-2-3. روش کار85
3-9. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید(تک بعدی)85
3-9-1. مواد مورد نیاز86
3-9-2. آماده­سازی مواد86
3-9-3. روش کار88
3-9-3-1. رنگ­­آمیزی کوماسی بلو R-25090
3-9-3-2. رنگ­آمیزی Blue Silver Staining90
3-10. تصویر برداری و آنالیز ژل­ها90
فصل چهارم- نتایج91
4-1. جمعیت مورد مطالعه92
4-2. درصد سویه­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جمع­آوری شده از بیماران با توجه به موضع جداسازی93
4-3. مشاهده لام رنگ­آمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O93
4-4. مشاهده لام رنگ­آمیزی ذیل-نلسون94
4-5. نتایج کشت­ها94
4-6. آزمون­های بیوشیمیایی وحساسیت آنتی­بیوتیکی95
4-7. نتایج تعیین غلظت پروتئین­ها97
4-8. نتایج مربوط به تفکیک پروتئین­ها بر اساس وزن مولکولی98
فصل پنجم- بحث و نتیجه گیری102
پیشنهاد108
منابع109
چکیده انگلیسی117
  
 
فهرست نمودارها 
2-1: میزان بروز بیماری سل در طول 46 سال گذشته در ایران41
4-1: نتایج کشت مثبت92
4-2: منحنی استاندارد98
 
فهرست جداول 
2-1:  تاکسونومی اعضای کمپلکس توبرکلوزیس15
2-2: داروهای خط دوم درمان توبرکلوزیس32
2-3: تخمین موارد ومتوسط میزان بروز سل در جهان در سال201040
2-4: به تفکیک دانشگاه­های علوم پزشکی کشور42
2-5: برخی تغییرات ژنی در سویه­های BCG  M. bovis47
3-1: نحوه گزارش میکروسکوپی71
3-2: مواد تشکیل­دهنده بافرتخلیص81
3-3: مواد تشکیل­دهنده محلول PBS x1083
3-4: مواد تشکیل­دهنده محلول برادفورد85
3-5: مواد تشکیل­دهنده Running Buffer 10%86
3-6: مواد تشکیل­دهنده Coomassie Gel stain87
3-7: مواد تشکیل­دهنده Coomassie Gel Destain87
3-8: مواد تشکیل­دهنده Fixation solution87
3-9: مواد تشکیل­دهنده Stainining solution88
3-10: مواد تشکیل­دهنده ژل 10%,12.5%   Separating89
3-11: مواد تشکیل­دهنده ژل  Stacking 5%89
4-1: درصد نمونه­های بالینی93
4-2: نتایج تست­های بیوشیمیایی96
4-3: نتایج تست­های حساسیت آنتی­بیوتیکی و  TCH97
فهرست تصاویر
2-1: استخوان سـتون فقرات بدشـکل در مومیایی، به­دلیل بیماری سـل11
2-2: عکس­برداری توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس16
2-3: کلنی­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون17
2-4: نمای شماتیک ازساختمان دیواره مایکوباکتریوم توبرکلوزیس22
2-5: میزان بروز مایکوباکتریوم توبرکلوزیس درنقاط مختلف جهان در سال 201240
2-6: درخت تبارشناسی زیرسویه­های مختلف BCG M. bovis بر اساس اطلاعات پراکندگی آن­ها و خصوصیات مولکولی46
2-7: برخی از عکس­های تاریخی مربوط به کاشفان واکسن ب ث ژ49
3-1: مرحله دیالیز84
3-2: آماده­سازی صفحات شیشه­ای88
4-1: باسیل اسید فست در رنگ امیزی اورامین93
4-2: باسیل اسید فست در رنگ امیزی ذیل-نلسون94
4-3: فاکتور طنابی (cord factor)95
4-4: تفسیر تست نیترات95
4-5: باندهای پروتئین­های غشایی سویه­های M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل 10% و رنگ آمیزی آمیزی کوماسی بلو R-25099
4-6: باندهای پروتئین­های غشایی سویه­های M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل 10%  رنگ آمیزی Blue Silver Staining100
4-7: باندهای پروتئین­های ترشحی سویه­های M. bovis و M. TB101
5-1: تصویر A سویهM. tuberculosis H37Rv  و تصویرB سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس106
 
 چکیدهمایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل بیماری سل می­باشد. از زمانی که سازمان جهانی بهداشت در سال 1993، توبرکلوزیس را به عنوان یک فوریت اعلام نمود، تا کنون کنترل آن به دلیل وجود سوش­های مقاوم به درمان و تداخل با بیماری ایدز دچار مشکل شده است. مایکوباکتریوم بوویس به عنوان عامل سل گاوی به صورت موردی انسان را نیز درگیر می کند و به عنوان یکی از معضلات بهداشتی با گستره جهانی محسوب می­شود. مبارزه با این آلودگی امروزه باعث گسترش بررسی آنتی­ژن­های باکتری به منظور دسترسی بیومارکرهای موثر در تشخیص، اهداف دارویی و اجزای واکسن مورد اهمیت واقع شده­­اند.جهت مقایسه پروفایل پروتئینی سویه­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس به درمان و مایکوباکتریوم بوویس از کل نمونه­های ارسالی 6 ماهه اول سال 1392 به بخش مایکوباکتریولوژی انسیتو پاستور، 100 نمونه مورد ارزیابی قرار گرفت. در ابتدا نمونه­های کلینیکی با روش ان استیل- ال سیستئین- هیدروکسید سدیم و در محیط کشت لونشتاین جانسون کشت داده شد و جهت افتراق مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و مایکوباکتریوم بوویس از سایر مایکوباکتریوم­ها، از تستهای بیوشیمیایی (نیترات، کاتالاز، نیاسین و TCH) و حساسیت آنتی بیوتیکی استفاده شد. کلونی­ها در محیط میدل بروک 7H9 کشت داده شد، پس از برداشت کلونی­های جدید، به منظور استخراج پروتئین­های ترشحی و غشایی از روشهای سونیکاسیون، رسوب دهی با سولفات آمونیوم و الکل استفاده گردید و به وسیله روش برادفورد تعیین غلظت شد  و در نهایت مقایسه با روش الکتروفورز تک بعدی انجام پذیرفت.با بررسی باندهای حاصله از پروتئین­های غشایی و ترشحی در 5 سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس هیچگونه تفاوتی مشاهده نشد و همچنین در 5 سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم بوویس نیز تفاوتی مشاهده نشد. در سویه­های مایکوباکتریوم بوویس، برای پروتئین­های غشایی باندهایی در محدوده 15 تا 85 کیلودالتون مشاهده شد و در سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس نیز باندهای از 15 تا 120 کیلودالتون مشاهده شد این دو سویه در محدوده­های وزنی تقریبا 30 تا 116 کیلو دالتون بسیار متفاوت بوده­اند.در بررسی پروتئین­های ترشحی در سویه­های مایکوباکتریوم بوویس، باندهایی در محدوده 15 تا 115 کیلودالتون و در سویه­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس باندهایی از 18 تا 114 کیلودالتون مشاهده شدند که اختلافات وزنی کمی در این محدوده­ها مشاهده شد.نتایج حاصل از تفکیک باندهای پروتئینی سویه­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس، حاکی از شباهت نسبی با سویه استانداردM. tuberculosis H37Rv  نسبت به مطالعات دیگر است. اختلافات مشاهده شده در باندهای حاصله از هر دو نوع پروتئین­های سویه­های مایکوباکتریوم بوویس و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس می­تواند مرجعی برای بررسی­های بیشتر پروتئومیکس در باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و بوویس باشد.به نظر می­رسد اختلاف بیان باندهای پروتئینی سویه­های حساس و بوویس با به کارگیری روشهای مناسب می­تواند به عنوان پروتئین مارکر و یا حتی بیومارکر موثر در تشخیص سویه­های حساس و بوویس از یکدیگر، اهداف دارویی و اجزای واکسن قابل استفاده باشد.                        فصل اولمقدمه1-1. کلیات سلسل بیماری است که از دیرباز در بین جوامع مختلف شیوع داشته است و عامل آن را از اسکلت انسان­های عصر حجر و استخوان­های مومیایی شده مصریان باستان جدا کرده­اند .(Zink A R. et al., 2003) امروزه یکی از بزرگترین مسائل بهداشتی جهان، بیماری سل است. حدس زده میشود که از هر سه نفر جمعیت جهان، یک نفر به باسیل سل آلوده بوده و درهر ثانیه یک نفر به تعداد آنان افزوده می­شود. نگران کننده این است که طبق برآوردهای موجود 50 میلیون نفر از این افراد، به باسیل سل مقاوم به چند دارو (MDR-TB) آلوده هستند. درحال حاضر 12 میلیون نفر درجهان به بیماری سل مبتلا هستند که بیش از 80% این موارد، تنها مربوط به 22 کشور درحال توسعه جهان است.در سال 2010 میلادی، حدود 8/8 میلیون نفر جدید به سل فعال مبتلا شده و حدود 1/1 میلیون نفر در اثر این بیماری جان می­سپارند. بیش از 90% موارد بیماری و مرگ ناشی از سل در کشورهای در حال توسعه رخ می­دهد، کشورهایی که 75% موارد بیماری در آنها به فعال­ترین گروه سنی به لحاظ اقتصادی (یعنی 15 تا 54 سالگی) تعلق دارد.آلودگی هم­زمان به ویروس ایدز خطر ابتلا به بیماری سل را به طور معنا داری افزایش می­دهد. کشورهای با شیوع بالای HIV، به ویژه کشورهای واقع در افریقای زیر صحرا، شاهد افزایش چشمگیر تعداد بیماران مبتلا به سل و افزایش 2 تا 3 برابر میزان­های بروز گزارش شده سل در دهه 90 بوده­اند. در سال 2010، میزان شیوع عفونت اچ آی وی در میان بیماران مبتلا به سل در جهان 13% تخمین زده شده است (W.H.O., 2010).سل یک بیماری تنفسی است که راه عمده سرایت آن ذرات تنفسی[1] وخلط سینه بیماران[2] می­باشد. اما  روش­های سرایت دیگری همچون تلقیح مستقیم باسیل سل در پوست مجروح کسانی که با بافت آلوده سروکار دارند نیز توصیف شده است. ورود باسیل سل به بدن یک فرد ضرورتا ایجاد بیماری سل نمی­کند، اولین فاکتورهای افزایش دهنده امکان ابتلاء فرد آلوده شده، خصوصیات شخصی هر فرد (مانند سن، جنس، ساختمان بدن و حساسیت ژنتیکی)، عوامل اجتماعی (مانند فقر غذایی و شرایط زیستی) و عواملی نظیر سرکوب سیستم ایمنی[3] ناشی از داروهای استروئیدی یا بیماری­هایی نظیر سرطان خون، بیماری­های دستگاه رتیکولواندوتلیال، دیابت شیرین[4]، بیماری­های قارچی سیستمیک و ایدز[5] می­باشد (Jonas  V. et al., 1993).کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (MTB) [6]که شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس[7]، افریکانوم[8]، بوویس[9]، بوویس[10]BCG، کاپره­ای[11]، میکروتی(mycobacterium microti)، پنی­پدی،  dassie bacillusو کانتی (mycobacteriu canettii)، گرچه خصوصیات فنوتیپی متفاوتی در تست­های بیوشیمیایی از خود نشان می­دهند اما همولوژی بالایی به لحاظ ژنتیکی دارند  .(Somoskovi A. et al., 2007)افتراق اعضای کمپلکس توبرکلوزیس برای پیشبرد درمان موفق ضروری است بالاخص در مناطقی که بیماری به صورت اپیدمیک در می­آید یا تماس انسان و حیوان زیاد است  .(Barouni A.S. et al., 2004)همان­طور که ذکر شد M. bovis یکی از قدیمی­ترین و مهمترین عامل بیماری سل بین انسان و دام (Zoonoses) و به عنوان یکی از معضلات بهداشتی با گستره جهانی محسوب می­شود. میزان مرگ و میر ناشی از  M. bovis بیشتر از M. tuberculosis می­باشد .(Majoor C.J. et al., 2011)  تشخیص M. bovis و M. bovis BCG  از دیگر اعضای کمپلکس MTB بدلیل مقاومت ذاتی (Scorpio A. et al., 1997)  آنها به آنتی بیوتیک پیرازینامید[12] از اهمیت راهبردی برخوردار است  .(Jure´en P. et al., 2008)این در حالی است که مقاومت به پیرازینامید در مایکوباکتریوم­های غیر کمپلکس MTB عمومیت ندارد .(Sun Z. et al., 1997)  پیرازینامید جزو داروهای خط اول مقابله با بیماری سل و قادر به از بین بردن  باکتری­های غیر فعال و احتمالا داخل سلولی است. این خصوصیات امکان کاهش زمان درمان از ۱۲-۱۸ ماه به ۶ ماه را امکان­پذیر می­کند (Lee K.W. et al., 2001).روش­های کلاسیک افتراقM. tuberculosis  و M. bovis و تست­های حساسیت به دارو بر پایه­ی احیای نیترات[13]، فعالیت آنزیم پیرازینامیداز (Pyrazinamide)، تجمع نیاسین و رشد در محیط تیوفن ۲-کربوکسیلیک اسید هیدرازید[14] استوار است  .(Monteros L. et al., 1998)تعداد صفحه : 116قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید