پایان نامه ارشد:مقایسه ی میزان وقوع آپوپتوزدر بافت بیضه ی موش نابالغ پس از استفاده از دو روش انجماد شیشه ای متفاوت

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

گرایش :سلولی تکوینی

عنوان : مقایسه ی میزان وقوع آپوپتوزدر بافت بیضه ی موش نابالغ پس از استفاده از دو روش انجماد شیشه ای متفاوت

دانشگاه علم و فرهنگ

پایان‌نامه کارشناسی ارشد

رشته زیست شناسی سلولی تکوینی

 

 عنوان:

مقایسه ی میزان وقوع آپوپتوزدر بافت بیضه ی موش نابالغ پس از استفاده از دو روش انجماد شیشه ای متفاوت

اساتید راهنما

دکتر بیتا ابراهیمی

دکتر عبدالحسین شاهوردی

 

شهریور ماه 1393

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                    صفحه

فصل اول: مقدمه1
1-1-مقدمه2
1-2-انجماد2
1-2-1-تاریخچه ی انجماد3
1-2-2-تکنیک های مختلف انجمادی3
1-2-2-1-انجماد آهسته4
1-2-2-2-انجماد شیشه ای5
1-2-3-محلول های انجمادی5
1-2-3-1-ضدیخ ها5
1-2-3-2-سرم7
1-2-4-تاثیرات انجماد بر بافت بیضه7
3- 1-3-پیوند9
4- 1-4-کشت10
5- 1-5-تغییرات ملکولی متاثر از انجماد11
1-5-1-آپوپتوزیس12
1-5-1-1-مسیر خارجی آپوپتوز و ژن های دخیل در آن13
1-5-1-2-مسیرداخلی آپوپتوز و ژنهای دخیل در آن14
1-5-1-3-P5316
1-5-1-4-کاسپاز 317
1-6-هدف18
1-7-پرسش پژوهشی18
1-8-فرضیات18
فصل دوم : مواد و روش ها19
2-1-تهیه ی بافت بیضه و گروه های مورد مطالعه20
2-2-انجماد شیشه ای بافت بیضه21
2-2-1-روش تهیه محیط پایه21
2-2-2-روش تهیه محلول های انجماد شیشه ای21
2-2-2-1-روش آماده سازی محلول انجمادی I21
2-2-2-2-روش آماده سازی محلول انجمادی II22
2-2-3-مراحل انجماد شیشه ای22
2-2-3-1-روش انجمادی I22
2-2-3-2-روش انجمادی II23
2-2-4-ذوب بافت بیضه23
2-2-4-1-روش تهیه محلول های ذوب23
2-2-4-2-مراحل ذوب23
2-5-مطالعات میکروسکوپی و بافت شناسی بافت بیضه24
2-6-بررسی آپوپتوز و بقا سلولی26
2-6-1-هضم مکانیکی و آنزیمی بافت بیضه26
2-6-1-1-هضم مکانیکی27
2-6-1-2-هضم آنزیمی27
2-6-1-3-خنثی سازی اثر آنزیم و بررسی بقا با استفاده از رنگ PI27
2-6-2-ارزیابی بقای سلولی به روش فلوسایتومتری28
2-6-3-بررسی آپوپتوز سلولی29
2 -7-کشت بافت بیضه30
2-7-1-آماده سازی آگار30
2-7-2-آماده سازی محیط کشت31
2-7-2-1-روش تهیه محیط RPMI31
2-7-3-کشت بافت بیضه32
2-8-ارزیابی ژن های آپوپتوزی32
2-8-1-نگهداری بافت در محلول RNA-later32
2-8-2-استخراج RNA با استفاده از ترایزول32
2-8-2-1-هموژن کردن بافت

2-8-2-2-مرحله ی جداسازی

33

33

2-8-2-3-رسوب RNA33
2-8-2-4-شستشو RNA33
2-8-3-بررسی کیفی RNA های استخراج شده34
2-8-4-تیمار نمونه­یRNA  با استفاده از DNase1 جهت حذف آلودگی ژنومی34
2-8-5-سنتز cDNA35
2-8-6-پرایمر37
2-8-6-1-آماده سازی پرایمرها37
2-8-6-2-بررسی جایگاه اتصال پرایمرها39
2-8-7-الکتروفورز39
2-8-7-1-روش ساخت بافر50X TAE39
2-8-7-2-روش ساخت بافر X TAE140
2-8-7-3-طرز تهیه ی ژل آگارز40
2-8-7-4-بررسی آلودگی پرایمر40
-8-7-4-بررسی کیفیت RNA41
2-8-8-بررسی گرادیانت دمایی پرایمر41
2-8-9 Real-Time PCR42
2-8-9-2-بررسی کمی بیان ژن با استفاده از روش Real-Time PCR43

 

2-9-آنالیز آماری داده44
فصل سوم: نتایج45
3-1-بررسی مورفولوژی بافت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین46
3-2-مقایسه بقای سلولی در گروه کنترل با گروه های انجمادی I و II بلافاصله پس از ذوب46
3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه47
3-3-1-ارزیابی میزان بقای سلولی طی کشت بافت بیضه47
3-3-2-آپوپتوز اولیه ی سلولی طی کشت بافت بیضه47
3-3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه48
3-3-4-نکروز بافتی طی کشت بافت بیضه48
3-4-بررسی بیان ژن های آپوپتوزی در سطح رونوشت49
3-4-1-بررسی بیان رونوشت ژن های دخیل در مسیر های آپوپتوزی49
3-4-2-Bax49
3-4-3-BCL249
3-4-4-نسبت بیان BAX به BCL250
3-4-5-Caspase350
3-4-6-Fas50
3-4-7-Fas Ligand51
3-4-8-P5351
27- فصل چهارم: بحث66
4-1-کلیات67
4-2-بررسی های مورفولوژیک در ساعات مختلف کشت در گروه های مورد مطالعه68
4-3-بررسی بقا و آپوپتوز سلولی در گروه های مورد مطالعه69
4-4-بررسی بیان ژن های مرتبط با وقوع آپوپتوز در گروه های مورد مطالعه71
4-5-نتیجه گیری75
4-6-پیشنهادات76

 

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                    صفحه

جدول 2-1-مراحل رنگ آمیزی  هماتوکسیلین ایوزین26
جدول2-2-مشخصات پرایمرهای مورد استفاده39
جدول 2-3-برنامه ی مورد استفاده جهت بررسی گرادیانت دمایی پرایمرها42
جدول 3-1- میانگین بقای سلولی درگروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II53
جدول3-2- میانگین بقای سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف53
جدول 3-3- میانگین درصد آپوپتوز اولیه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت54
جدول 3-4-میانگین درصد آپوپتوز ثانویه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II  در ساعت های مختلف کشت54
جدول 3-5- میانگین درصد سلول های نکروتیک در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II  در ساعت های مختلف کشت55
جدول 3-6-میزان بیان ژن Bax در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت55
جدول 3-7-میزان بیان ژن BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت5356
جدول3-8-نسبت بیان  BAX به BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت56
جدول3-9-میزان بیان ژن Caspase3 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت57
جدول 3-10-میزان بیان ژن Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت57
جدول 3-11-میزان بیان ژنLigand   Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت58
جدول 3-12- میزان بیان ژن P53 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت58

 

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                                     صفحه

شکل 1-1-مسیرهای شرکت کننده در رخداد آپوپتوز16
شکل2-1-ارزیابی بقای سلولی با روش فلوسایتومتری28
شکل2-3-ارزیابی وقوع آپوپتوز30
شکل3-1-داده های حاصل از آنالیز بقای سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II در زمان صفر59
شکل3-2-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت صفر60
شکل3-3-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت 3 پس از کشت61
شکل3-4-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت 20 پس از کشت62
شکل 3-5-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی در زمان صفر بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین63
شکل 3-6-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی 3 ساعت پس ازکشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین64
شکل 3-7- بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی 20 ساعت پس از کشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین65

چکیده

گرچه انجماد بافت بیضه روشی مناسب جهت حفظ باروری در کودکان مبتلا به سرطان است اما القای آپوپتوز و مرگ سلولی تحت تاثیر فرآیند انجماد نکته ی مهمی است که باید مورد توجه قرار گیرد. هدف از انجام این پژوهش ارزیابی میزان آپوپتوز سلولی پس از انجماد شیشه ای بافت بیضه ی موش نابالغ با دو روش انجمادی مختلف و کشت کوتاه مدت آن است.

بافت های بیضه از موش های سوری نر نابالغ 7 روزه جدا شد و به طور تصادفی در سه گروه کنترل ، انجمادیI و انجمادی II تقسیم گردید. در گروه انجمادی I، بافت ها با استفاده از غلظت های افزایشی ضدیخ های DMSO و EG و در گروه انجمادی II، با استفاده از  غلظت افزایشی ترکیب سوکروز و EG منجمد شدند. نمونه های انجمادی پس از ذوب همراه با نمونه ها ی کنترل به مدت 20 ساعت در محیط کشت RPMI حاوی 10% سرم KOSR کشت داده شدند. بلافاصله پس ازذوب (ساعت صفر) ،3 و 20 ساعت پس از کشت، مورفولوژی، بقای سلولی، میزان وقوع آپوپتوز سلولی و میزان بیان ژن ها آپوپتوزی  (BAX, BCL2,Caspase3, Fas, Fas ligand,P53)، با استفاده از روش های میکروسکوپ نوری، آنالیز فلوسایتومتری و Real-Time PCR مورد بررسی قرار گرفت.

روش انجمادی I در مقایسه با روش انجمادی II از لحاظ حفظ یکپارچگی بافت و بقای سلولی مشابه نمونه ی کنترل بود. آپوپتوز اولیه ی سلولی نیز طی ساعات کشت در گروه های انجمادی به طور معناداری (P<0/05) کاهش یافت ولی آپوپتوز ثانویه ی سلولی در گروه های انجمادی در ساعت 3 پس از کشت در مقایسه با زمان صفر به طور معناداری (P<0/05) افزایش یافت در حالی که در ساعت 20 پس از کشت در صد سلول هایی که دچار آپوپتوز ثانویه شده بودند در گروه انجمادی I و گروه کنترل در مقایسه با گروه انجمادی II به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود. میزان بیان ژن BAX در گروه انجمادی I در مقایسه با گروه کنترل در طی ساعات کشت به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود. بیان ژن BCL2 در گروه های انجمادی در طی ساعات کشت کاهش یافت ولی این کاهش معنادار نبود. ژن Caspase3 در همه ی گروه ها در زمان 3و 20 در مقایسه با زمان صفر کاهش معناداری (P<0/05) را نشان داد. بیان ژن های  Fasو Fas Ligand در ساعت 3 پس از کشت در گروه های انجمادی در مقایسه با زمان صفر افزایش معناداری (P<0/05) یافت. میزان بیان ژن p53 در گروه های کنترل و انجمادی I در ساعت 3 و 20 در مقایسه با زمان صفر کاهش معناداری (P<0/05) را نشان داد ولی بیان این ژن در گروه انجمادی II در طی فرآیند کشت نسبتا ثابت بود.

با توجه به نتایج بدست آمده به نظر می رسد هر دو روش انجمادی به کار برده شده سبب وقوع مرگ سلولی از طریق مسیر نکروزی و آپوپتوزی می شوند، اما روش انجمادی I در مقایسه با روش انجمادی II مرگ سلولی را بیشتر از طریق آپوپتوز القا می کند تا نکروز. از سوی دیگر با توجه به تغییرات الگوی بیان ژن P53 در حین فرآیند کشت در هر دو گروه انجمادی می توان نتیجه گرفت که رخداد آپوپتوز پس از انجماد در بافت بیضه مستقل از ژن P53 است.

کلمات کلیدی: بافت بیضه، انجماد شیشه ای، رخداد آپوپتوز

فصل اول

مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته

1-1-­­­­­مقدمه

به واسطه ی پیشرفت های امروزه در زمینه­ی درمان بیماری سرطان، تعداد افراد بهبود یافته از آن به طور چشم گیری افزایش یافته است، به گونه ای که حدود 80% از کودکان مبتلا به سرطان که تحت درمان بوده اند، سلامتی خود را مجددا به دست آورده اند (1)، ولی با این وجود حدود یک سوم این کودکان به دلیل حساسیت بالای سلول های اسپرماتوگونی موجود در بیضه، دچار اختلال عملکرد سیستم باروری و ناباروری شده اند (2). بدلیل عدم امکان حفظ باروری از طریق انجماد اسپرم در کودکان نابالغ می توان از انجماد و نگهداری بافت بیضه با هدف پیوند بافت، کشت بافت و یا پیوند سلول های آن به عنوان یک استراتژی مناسب جهت حفظ باروری استفاده کرد (3). علاوه بر کودکان مبتلا به سرطان می توان از این روش، برای حفظ باروری در افراد بزرگسال (4)، افراد مبتلا به بیماری های سیستمیک و بیماری های خونی (5)، گنادکتومی ها (6)، سندرم کلاین فلتر (7)، کریپتورکیدیسم (8) و غیره استفاده کرد. از دیگر مزایای این روش حفظ منابع ژنتیکی حیوانات در معرض خطر انقراض است.

تعداد صفحه : 108

قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09199970560        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

شماره کارت :  6037997263131360 بانک ملی به نام محمد علی رودسرابی

11

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید