پایان نامه ارشد: بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش Swim-up در زمان های مختلف

دانلود متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی

عنوان : بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش  Swim-up در زمان های مختلف

دانشگاه مازندران

دانشکده علوم پایه

پایان نامه ی دوره ی کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی سلولی و مولکولی

موضوع:

بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش   Swim-up در زمان های مختلف

اساتید راهنما:

دکتر فاطمه رودباری

دکتر محمد علی خلیلی

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکیده:

یکی از علت های شکست و عدم موفقیت در تکنیک های کمک باروری(ART) قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی است، که ممکن است با انکوباسیون طولانی مدت اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد به وجود آید. لذا در این مطالعه میزان قطعه قطعه شدن و آپوپتوز DNA اسپرم انسانی بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up در زمان های مختلف انکوباسیون به وسیله تست SCD و تکنیک TUNEL مورد ارزیابی قرار گرفت.

در این مطالعه آینده نگر، بیست ویک نمونه ی اسپرم نرمال مورد مطالعه قرار گرفت. برای بررسی مورفولوژی اسپرم از رنگ آمیزی  Papanicolaou و قابلیت حیات اسپرم از رنگ آمیزی Eosin-Nigrosin  استفاده شد. نمونه ها در دمای 37 درجه سانتی گراد بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up در زمان های مختلف انکوبه شدند. قطعه قطعه شدن DNA در فواصل زمانی مختلف (3،2،1،0 ساعت) با استفاده از تست SCD مورد بررسی قرار گرفت. اسپرم های دارای هاله بزرگ و متوسط، DNA سالم داشتند و اسپرم هایی که دارای هاله کوچک و بدون هاله بودند DNA قطعه قطعه شده داشتند. میزان آپوپتوز نیز به وسیله تکنیک TUNEL مورد ارزیابی قرار گرفت.

میانگین مورفولوژی نرمال و حرکت پیشرونده اسپرم بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up  53/2±33/72 و 02/1±10/90 بوده است. میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم به میزان معنی داری افزایش یافت بعد از دو ساعت (935/0±81/8، 004/0 P=) و بعد از سه ساعت (894/0±76/10، 0001/0 P=) انکوباسیون نسبت به زمان صفر (809/0±38/4) بوده است. همچنین میزان آپوپتوز DNA اسپرم در زمان دو ساعت انکوباسیون نسبت به زمان صفر  (864/0±19/9، 008/0 P=) و نیز زمان سه ساعت نسبت به زمان یک ساعت ( 7/0±97/10، 002/0 P=) انکوباسیون معنی دار شده است.

در نهایت نتیجه ای که ما به آن دست یافته ایم نشان می دهد که انکوباسیون اسپرم نرمال در دمای 37 درجه سانتی گراد که به روش Direct swim-up آماده شده برای استفاده در تکنینک های کمک باروری (ART) باید زمانی کمتر از دو ساعت باشد.

فهرست مطالب:

فصل اول- مقدمه………………………………………………………………………………….1

1-1- روش های کمک باروری……………………………………………………………………2

1-2- ناباروری…………………………………………………………………………………….5

1-3- تولید اسپرم ……………………………………………………………………………5

1-4- مایع انزالی…………………………………………………………………………………6

1-4-1- آنالیز مایع انزالی………………………………………………………………………7

1-5- پارامترهای اسپرم………………………………………………………………………10

1-5-1- مورفولوژی…………………………………………………………………………10

1-5-2- تحرک اسپرم………………………………………………………………………..12

1-5-3- درجه بندی تحرک اسپرم ………………………………………………………14

1-5-4- قابلیت حیات اسپرم…………………………………………………………..14

1-5-5- حجم…………………………………………………………………………………15

1-5-6- غلظت…………………………………………………………………………..16

1-6- انواع مرگ سلولی و تعریف آن…………………………………………….18

1-6-1- نکروز…………………………………………………………………………….18

1-6-2- آپوپتوز سلولی……………………………………………………………….18

1-6-2-1 مراحل آپوپتوز ………………………………………………………………..19

1-6-2-2 مسیر های آپوپتوز………………………………………………………..21

1-6-2-3- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز…………………………………21

1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز …………………………………………..23

1-6-2-4-1-  بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول ……………………23

1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول………………24

1-6-2-4-2-  بررسی سیتوتوکسیسیتی …………………………………………24

1-6-2-4-3-  بررسی تغییرات مورفولوژی ………………………………………..25

1-6-2-4-3-1-  استفاده از میکروسکوپ الکترونی………………………………25

1-6-2-4-3-2-  استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس……………………25

1-7-  منشاء آسیب DNA اسپرم………………………………………………..26

1-7-1-  بسته بندی غیرطبیعی کروماتین…………………………………..27

1-8-  ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری ………………………..28

1-8-1-  بررسی ساختار کروماتین اسپرم………………………………………28

1-9-  نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم…………………………………..29

1-10-  استرس اکسیداتیو به واسطه ROS……………………………………..

1-11-  تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA  و میزان موفقیت روشهای کمک باروری……..31

1-11-1-  مصرف سیگار…………………………………………………………….31

1-11-2-  مواجهات شغلی…………………………………………………………..32

1-11-3-  داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی……………………………….33

1-11-4-  سن……………………………………………………………………..33

1-12-  تکنیک­های بررسی ساختار کروماتین……………………………………….33

1-12-1-  روش­های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان………………………….34

1-12-1-1- تست TUNEL…………………………………………………………..

1-12-1-2- روش DBD-FISH………………………………………………………….

1-12-1-3- روش Comet………………………………………………………

1-12-1-4- رنگ­آمیزی CMA3………………………………………………………..

1-12-1-5- تکنیک SCSA…………………………………………………………..

1-12-1-6- تست  SCD……………………………………………………………….

1-12-1-7- رنگ­آمیزی آکریدین اورانژ…………………………………………….39

1-12-1-8- رنگ­­آمیزی تولوئیدین بلو…………………………………………….39

1-13- روش مهاجرت اسپرم…………………………………………………………39

1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت…………………………………………..40

فصل دوم- مواد و روش ها…………………………………………………………41

2-1- مواد و وسایل  مورد نیاز……………………………………………………….42

2-1-1- وسایل مورد نیاز………………………………………………………….42

2-1-2- مواد مورد نیاز…………………………………………………………..42

2-2- ساخت محلول های مورد نیاز…………………………………………….45

2-2-1- ساخت محلول Ham’s F10……………………………………………….

2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)………….46

2-2-3- ساخت محلول تانل…………………………………………………………46

2-2-4- ساخت محلول (PBS)…………………………………………………….46

2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین………………………………………………….47

2-2-6- ساخت رنگ رایت………………………………………………………………..47

2-3- روشها…………………………………………………………………………….48

2-3-1- روش جمع آوری اسپرم……………………………………………. 48

2-3-2- آنالیز مایع انزالی…………………………………………………………….. 48

2-3-2-1- آزمایشات ماکروسکوپی……………………………………………….48

2-3-2-1-1-  ظاهر……………………………………………………………………….48

2-3-2-1-2- آبکی کردن………………………………………………………………..48

2-3-2-1-3-  حجم…………………………………………………………………..48

2-3-2-1-4-  چسبندگی………………………………………………………….48

2-3-2-2- آزمایشات میکروسکوپی……………………………………………………49

2-3-2-2-1- آگلوتیناسیون………………………………………………………….50

2-3-2-2-2- بررسی تعداد اسپرم………………………………………………………50

2-3-2-2-2-1- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش …………50

2-3-2-2-3- ارزیابی تحرک……………………………………………………….51

2-3-2-2-3-1- روش کار……………………………………………………………52

2-3-2-2-4- ارزیابی قابلیت حیات………………………………………………….53

2-3-2-2-4-1- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین………………………….53

2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی…………………………………………………54

2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا………………………………………….54

2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن………………………………………………54

2-3-2-2-5-3-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا…………………………………….55

2-3-3-  Direct swim-up……………………………………………………….

2-3-3-1- روش کار………………………………………………………………….57

2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)…………….58

2-3-4-1- روش کار………………………………………………………………..58

2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل……………………………………………………60

2-3-6- آنالیز آماری……………………………………………………………….62

فصل سوم- نتایج……………………………………………………………….63

3-1 نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی تحرک اسپرم…………..64

3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قابلیت حیات اسپرم….67

3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی مورفولوژی اسپرم..68

3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم…70

3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………..72

3-6- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی آپوپتوز اسپرم….75

3-7- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم………..78

3-8- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم………………………..79

3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم……………80

3-10- نتایج کلی……………………………………………………………………………80

فصل چهارم- بحث………………………………………………………………………….81

4-1- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم……………83

4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم……84

4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………..90

فصل اول: مقدمه

1-1- روش های کمک باروری

امروزه استفاده از روش های کمک باروری ([1]ART) بهترین گزینه برای رفع مشکلات زوج های نابارور است. میزان موفقیت این روش ها به عوامل متعددی از جمله سلامت کامل تخمک و اسپرم بستگی دارد. در این میان سلامت ژنوم پدری اهمیت زیادی در میزان پتانسیل باروری زوج ها دارد. بنابراین آسیب DNA اسپرم یک اختلال ژنومی است که به میزان متفاوت در مردان نابارور وجود دارد. از زمانی که اولین گزارش در مورد آسیب DNA اسپرم منتشر شد مطالعات وسیعی در این زمینه انجام گرفته و مشخص شده که در افراد دارای میزان بالای آسیب DNA، پارامترهای اسپرمی پایین می آید و قدرت باروری نیزکاهش می یابد.

از سالها پیش، استفاده از جراحی برای رفع نقایص ساختمان دستگاه تولید مثل، استفاده از داروهای باروری برای تحریک تخمک­گذاری و روش IUI[2] (انتقال اسپرم متحرک و شسته شده به رحم) از جمله روش­های رایج درمانی بوده و هستند. لیکن این اقدامات تنها برای گروهی از زوج­های نابارور مؤثر است. این در حالی است که روش­های جدیدی از جمله IVF [3] و ICSI [4] امروزه به عنوان گزینه­هایی مناسب  در درمان سایر زوجین نابارور مطرح است.

میزان موفقیتART  به سلامت و بلوغ گامت های زوجین وابسته است . طی لقاح طبیعی و روش لقاح آزمایشگاهیIVF احتمال نفوذ اسپرماتوزوای غیربالغ و ناسالم به داخل تخمک توسط سد زوناپلوسیدا به حداقل می رسد در صورتی که در روش میکرواینجکشن یا تزریق مستقیم اسپرم به داخل سیتوپلاسم تخمک ICSI این سد وجود نداشته و ایمن بودن روش ICSI همیشه مورد نگرانی بوده است . در ضمن تحقیقات نشان داده است که انتخاب اسپرم با پارامترهای معمولی (غلظت، مورفولوژی، تحرک ) نمی تواند گویای سلامت DNA اسپرم باشد(EI, MI, López-Fernández, Fernández, & Gosálvez, 2007).  به تازگی لوئیس و سیمون (2010) اظهار داشتند که هیچ همبستگی بین پارامتر های معمولی اسپرم و آسیب DNA وجود ندارد(S. E. M. Lewis & Simon, 2010).

یکی از روش های کمک باروری روش تلقیح داخل رحمی (IUI)  می باشد. که در این روش مایع انزالی از شوهر گرفته می شود و پس از عمل شستشو و جداسازی ، اسپرم های مرده و بدون تحرک از اسپرم های زنده و دارای تحرک جدا می شوند، سپس اسپرم های زنده و متحرک به وسیله کاتتر توسط متخصص، وارد حفره رحم می گردد.

در آزمایشگاه های ART، بعد از عمل شستشو و جداسازی معمولاَ به بررسی پارامترهای اسپرم که شامل تعداد، میزان تحرک و وضیعت مورفولوژیکی اسپرم و درصد زنده بودن می باشد، می پردازند اما به بررسی پارامترهای درون سلولی که شامل آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم است پرداخته نمی شود. همچنین در آزمایشگاه های ART معمولاَ انجام روش IUI  از 5/0 تا حداکثر 3 ساعت بعد از عمل جداسازی و شستشو اسپرم انجام می دهند و در بعضی از مراکز درمان ناباروری بدون توجه به زمان، عمل تلقیح را انجام می دهند. با توجه به نقش اسپرم در پروسه لقاح در روش IUI، لازم است که علاوه بر توجه به ساختار سلولی اسپرم به بهترین زمان ممکن جهت انجام تزریق اسپرم آماده شده به داخل حفره رحمی توجه شود. لذا با مطالعه ساختار سلولی اسپرم و نیز تعیین زمان دقیق عمل تزریق اسپرم به داخل حفره رحمی  می توان میزان لقاح و در نتیجه میزان حاملگی را افزایش داد.

یکی از عواملی که می تواند بر میزان موفقیت درمان زوج های نابارور و همچنین کیفیت گامت ها مهم باشد، کیفیت اسپرم است. در روش IUI بعد از جداسازی اسپرم از مایع منی و آماده سازی اسپرم برای انتقال، می تواند به خاطر انکوباسیون طولانی مدت، قطعه قطعه شدن DNA اسپرم افزایش پیدا کند(Muratori, et al., 2003).

مطالعات بیانگر این مطلب است که در تخمک های لقاح یافته با اسپرم های دارای آسیب بالای DNA، میزان لانه گزینی و بارداری به طور معنی داری کاهش می یابد . اگرچه ژنوم آسیب دیده پدری، طی رشد جنینی می تواند دستخوش پردازش قرار گیرد، ولی در صورت وجود آسیب های زیاد، احتمال کاهش رشد جنین وجود داشته و اگر میزان نقص ها کمتر باشد، می تواند نقایص بعد از تولد را به همراه داشته باشد. به همین دلیل، در دسته ای از بیماران، نوزادان متولد شده توسط روش ICSI دارای نقص ژنتیکی بیشتری نسبت به نوزادان طبیعی هستند .لازم به ذکر است که تحقیقات متعدد در این زمینه، نتایج ضد و نقیصی را گزارش کرده اند(Morris, Ilott, Dixon, & Brison, 2002).

تجربیات به دست آمده از روش های کمک باروری نشان می دهد، چنانچه اسپرم با میزان بالایی از آسیب DNA، در روند IVF و ICSI وارد تخمک شود سیستم ترمیمی تخمک ممکن است توانایی ترمیم این آسیب ها را نداشته و در بسیاری از موارد با وجود موفقیت در لقاح، سلول های جنسی توانایی تشکیل جنین یا ادامه تکامل را تا مرحله بعد از 4 تا 8 سلولی که مصادف با فعال شدن ژنوم است، ندارند . براساس تحقیقات مشخص شده که توانایی ترمیم تخمک وابسته به سن مادر بوده و تخمک های افراد جوان، از قدرت ترمیم DNA بالایی برخوردارند . به علاوه تحقیقات متعدد در زمینه آسیب DNA بیانگر این هستند که ارتباط معنی داری بین آسیب DNA و میزان لقاح وجود ندارد ولی بین آسیب DNA اسپرم و تشکیل جنین، بلاستوسیت، رشد جنین و بارداری ارتباط معکوس و معنی داری وجود دارد(Morris, et al., 2002).

پس از آماده سازی اسپرم به طور معمول در 37 درجه سانتی گراد انکوبه می شود تا در ART از آن استفاده شود (Van der Westerlaken, Naaktgeboren, Verburg, Dieben, & Helmerhorst, 2006) ، ولی هنوز زمان بهینه برای انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد قبل از استفاده در ART وجود ندارد. بعضی از محققین سعی برای پیدا کردن اثر گذشت زمان بر پارامترهای اسپرم بعد از انکوبه کردن در دمای 37 درجه سانتی گراد را دارند. اثر انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد نشان داد که بعد از گذشت 24 ساعت می تواند بر روی تحرک و قابلیت حیات اسپرم تاثیر گذار باشد(Calamera, Fernandez, Buffone, Acosta, & Doncel, 2001).

بعد از آماده سازی اسپرم برای استفاده در تکنیک های ART انکوباسیون کوتاه مدت در دمای 37 درجه سانتی گراد می تواند باعث ظرفیت یابی اسپرم شود اما انکوباسیون طولانی مدت می تواند بر روی DNA اسپرم تاثیر داشته باشد(Marı́n-Briggiler, Tezón, Miranda, & Vazquez-Levin, 2002).

2-1- ناباروری

ناباروری به معنای عدم توانایی برای بچه دار شدن، بعد از یکسال مقاربت بدون جلوگیری می باشد. حدود 15-10 درصد در سنین باروری خود، با این مشکل مواجه می باشند. عدم برخورد صحیح با مسئله ناباروری می تواند منجر به بروز مشکلات روحی، روانی و اجتماعی گردد. طیف وسیعی از عوامل زنانه و مردانه در ناباروری نقش دارند. حدود50 درصد موارد ناباروری مربوط به فاکتورهای مردانه است و تقریباً 15-10 درصد موارد ناباروری علت نا مشخص دارد. علل  ناباروری مردان شامل طیف وسیعی از عوامل وراثتی، هورمونی، محیطی، فیزیولوژیک، مواد سمی و داروئی می باشد که سبب بروز علائمی چون عدم تولید اسپرم، تعداد بسیار کم یا کیفیت بد اسپرم های تولید شده می گردد(Agarwal & Said, 2003).

3-1- تولید اسپرم

تولید مثل جنسی شامل الحاق گامت نر و ماده است. منشاء مشترک اسپرم و تخمک، سلول های جنسی اولیه[1] است. در انسان وسایر پستانداران، سلول های جنسی اولیه در حدود هفته پنجم جنینی از کیسه زرده مشتق می شوند و با مهاجرت خود از طریق آلانتوئیس به آندودرم روده خلفی رفته و به دنبال آن وارد مزانتر پشتی شده و در نوار های تناسلی موجود در سمت پشتی جنین جای می گیرند. طناب های جنسی در دوران جنینی شکل می گیرند، در جنس نر هنگام تولید این طناب ها توپر بوده و دارای دو نوع سلول جنسی و غیر جنسی می باشند. سلول های جنسی دارای هسته ای بزرگ و روشن به همراه یک یا چند هستک است که بزرگتر از سلول های غیر جنسی می باشند. این سلول ها که اسپرماتوگونی[2] نوع A خوانده می شوند از تقسیمات میتوزی سلول های جنسی اولیه بوجود می آیند و بر روی غشاء پایه طناب های جنسی[3] قرار دارند. سلول های غیر جنسی کوچک تر می باشند و در اوایل دوران جنینی تکثیر یافته و سلول های سرتولی[4] (پشتیبان) را می سازند. با آغاز سن بلوغ، در پاسخ سیگنال های هیپو تالاموسی، سرعت تکثیر و تمایز این سلول ها بالا می رود و پس از مراحلی، به اسپرم بالغ تبدیل می شوند. مراحلی که موجب تکثیر سلول های اسپرماتوگونی، میوز و تغییرات مورفولوژیک آنها و در نهایت تبدیل اسپرماتوگونی به اسپرماتوزوئید می شود را اسپرماتوژنز[5] گویند (Guyton & Hall, 2006).

[1] Primordial germ cells

[2] Spermatogony

[3] Sexual cord

[4] Sertoli

[5] Spermatogenesis

[1] Assisted Reproductive Techniques

[2] Intrauterine insemination

[3] In vitro fertilization

[4] Intra Cytoplasmic Sperm Injection

تعداد صفحه : 119

قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید