پایان نامه ارشد رشته رشته زیست شناسی : بررسی ارتباط پیوستگی بین هموگلوبین D و انواع هاپلوتیپ­های مجموعه ژنی بتاگلوبین

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی گرایش ژنتیک

با عنوان : بررسی ارتباط پیوستگی بین هموگلوبین D و انواع هاپلوتیپ­های مجموعه ژنی بتاگلوبین

در ادامه مطلب می توانید تکه هایی از ابتدای این پایان نامه را بخوانید

و در صورت نیاز به متن کامل آن می توانید از لینک پرداخت و دانلود آنی برای خرید این پایان نامه اقدام نمائید.

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد دامغان

دانشکده علوم زیستی

پایان‌نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست‌شناسی

 گرایش ژنتیک

 عنوان

بررسی ارتباط پیوستگی بین هموگلوبین D و انواع هاپلوتیپ­های مجموعه ژنی بتاگلوبین در افراد مازندرانی

استاد راهنما

دکتر محمدرضا مهدوی

استاد مشاور

دکتر رضا نظام زاده

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی شود

تکه هایی از متن به عنوان نمونه : (ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان     صفحه

چکیده 1

فصل اول: مقدمه

1ـ1 بیان مسئله: 3

1ـ1ـ1 هموگلوبین.. 3

1ـ1ـ2 ساختمان هموگلوبین.. 3

1ـ1ـ3 بیان تکوینی هموگلوبین.. 5

1ـ1ـ4 ساختمان زنجیره گلوبین.. 7

1ـ1ـ5 خوشه ژنی آلفاگلوبین.. 7

1ـ1ـ6 خوشه ژنی بتاگلوبین.. 8

1ـ1ـ7 ناهنجاری های هموگلوبین در انسان. 8

1ـ1ـ8 اختلالات هموگلوبینهای انسانی.. 9

1ـ1ـ9 واریانت های ساختمانی زنجیره گلوبین.. 9

1ـ1ـ10 بیماری های سنتز زنجیره هموگلوبین.. 12

1ـ1ـ11 تالاسمی.. 12

1ـ1ـ12 مروری برهموگلوبینوپاتی های نادر گزارش شده در ایران. 12

1ـ1ـ13 هموگلوبین D.. 15

1ـ1ـ14 هاپلوتیپ.. 17

1ـ1ـ15 هاپلوتیپ های مجموعه ژنی بتاگلوبین.. 18

1ـ2 اهداف.. 19

1ـ2ـ1 هدف کلی طرح: 19

1ـ2ـ2 اهداف فرعی طرح: 19

1ـ2ـ3 اهداف اختصاصی طرح: 19

1ـ2ـ4 اهداف کاربردی طرح: 20

1ـ2ـ5 فرضیههای طرح: 20

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده

2ـ1 پیش زمینه. 22

2ـ2 تحقیقات و نتایج گذشته. 22

فصل سوم: مواد و روش­ها

3ـ1 مواد و روشها 28

3ـ1ـ1 مواد، تجهیزات و لوازم مورد استفاده 28

3ـ1ـ1ـ1 لیست دستگاهها و لوازم مورد استفاده برای اجرای این پایان نامه در جدول 3-1 آمده است. 28

3ـ1ـ1ـ2 مواد. 28

3ـ1ـ1ـ2ـ1 مواد مصرفی عمومی.. 28

3ـ1ـ1ـ2ـ2 مواد مصرفی شیمیایی.. 29

3ـ1ـ1ـ2ـ3 مواد مصرفی بیولوژیک… 29

3ـ1ـ1ـ2ـ4 محلولها 30

3ـ1ـ1ـ2ـ4ـ1 محلولهای لازم جهت استخراج.. 30

3ـ1ـ1ـ2ـ4ـ2 محلولهای لازم جهت واکنش PCR.. 30

3ـ1ـ1ـ2ـ4ـ3 محلول های لازم جهت الکتروفورز کردن DNA.. 31

3ـ1ـ2 روشها: 32

3ـ1ـ2ـ1 بیماران مورد مطالعه. 32

3ـ1ـ2ـ2 استخراج DNA ژنومی به روش نمک اشباع. 32

3ـ1ـ2ـ3 تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده 34

3ـ1ـ2ـ4 واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR). 35

3ـ1ـ2ـ5 تهیه ژل آگارز و الکتروفورز محصولات PCR.. 36

3ـ1ـ2ـ6 رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید و عکسبرداری از ژل. 37

فصل چهارم: نتایج

4ـ1 نتایج.. 39

4ـ1ـ1 جمعیت مورد مطالعه. 39

4ـ1ـ2 بررسی نتایج شناسایی هموگلوبین D.. 40

4ـ1ـ3 بررسی نتایج جایگاههای مجموعه ژنی بتاگلوبین: 41

4ـ1ـ4 بررسی جهش‌ها به روش حضور و یا عدم حضور جایگاه شناسایی آنزیم محدودکننده (RFLP). 43

4ـ1ـ5 بررسی هفت جایگاه درمجموعه ژنی بتاگلوبین به منظورشناسایی هاپلوتیپها توسط تکنیکRFLP-PCR : 44

4ـ1ـ6 آنالیز داده ها45

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5ـ1 بحث.. 49

5ـ2 نتیجه گیری.. 52

5ـ3 پیشنهادات.. 52

فهرست منابع. 53

منابع فارسی: 53

منابع انگلیسی: 53

Abstract 57

چکیده

مقدمه: هموگلوبین دی – پنجاب یکی از انواع هموگلوبینوپاتی ها می باشد که در آن جهش در موقعیت 121 بر روی زنجیره بتا رخ داده است. این اختلال هموگلوبین در هندوستان، پاکستان و ایران شایع می باشد.افراد هتروزیگوت برای این بیماری غالباً بدون علامت بالینی خاصی می باشند، در حالی که در حالت هتروزیگوت مرکب با هموگلوبین S افراد مبتلا، کم خونی داسی شکل را بروز می دهند. مطالعه قبلی درشمال کشور نشان داد که تمامی واریانت های هموگلوبین دی درساری از نوع دی – پنجاب می باشند ولی نوع هاپلوتیپ های همراه این واریانت شناخته نشده بود. هدف از این مطالعه شناسایی انواع هاپلوتیپ های همراه هموگلوبین دی در مجموعه ژنی بتاگلوبین بوده است.

مواد و روش­ها: در بررسی حاضر تعداد 18 نفر از خانواده های افرادی که دارای هموگلوبین دی – پنجاب بوده اند انتخاب گردیدند و DNA ژنومی از تمامی افراد با استفاده از روش استاندارد نمک اشباع استخراج گردید. سپس نوع هاپلوتیپ همراه هموگلوبین دی – پنجاب با استفاده از تکنیک PCR-RFLP و آنالیز پیوستگی در خانواده مشخص شد.

نتیجه: مطالعه حاضر نشان داد که در 17 خانواده از 18 خانواده بررسی شده آلل هموگلوبین دی با هاپلوتیپ    

– + +]- – – +[ پیوستگی دارد. و در تنها یک خانواده نیز آلل دارای هموگلوبین دی به همراه هاپلوتیپ[- + + – + + +] دیده شد.

بحث و نتیجه­گیری: مطالعه ما نشان داد بخش عمده واریانت هموگلوبین دی – پنجاب در ساری دارای منشاء یگانه می باشند و هاپلوتیپ نادر دیده شده احتمالا یا منشاء ژنتیکی متفاوتی دارد یا در اثر مکانیسم هایی از قبیل نوترکیبی ژنی به وجود آمده است

کلید واژه: هموگلوبین دی-پنجاب، هاپلوتیپ، PCR-RFLP، ساری

1ـ1 بیان مسئله:

1ـ1ـ1 هموگلوبین

نام هموگلوبین از واژه هم و گلوبین گرفته شده است که هر واحد هموگلوبین دارای پروتئین گلوبولار با گروه هم است و هر گروه هم در برگیرنده یک اتم آهن است که می تواند با یک مولکول اکسیژن از طریق نیروی دو قطبی آهن ترکیب شود ( پروتز[1]،1960). این پروتئین که ناقل اکسیژن در خون است برای اولین بار توسط هانفیلد در سال 1840 کشف شد و همچنین برای اولین بار نقش هموگلوبین در خون توسط فیزیولوژیست فرانسوی کلود برنارد مشخص شد (هانفیلد[2]1840). عمومی ترین نوع هموگلوبین در پستانداران شامل چهار زیر واحد است . هموگلوبین مهمترین وفراوانترین پروتئین موجـود در گلبول های قرمز بوده و نقش اساسی در حمل ونقل اکسیژن ودی اکسیدکربن و پروتون دارد (پروتز،1960).

1ـ1ـ2 ساختمان هموگلوبین

مولکول هموگلوبین همانطورکه دربالا به آن اشاره شده شامل دو بخش میباشد:

  • بخش پروتئینی موسوم به گلوبین که دارای چهار زنجیره پلی پپتیدی می باشد (تترامر است).
  • بخش غیر پروتئینی موسوم به هِم (heme) که به آن گروه پروستتیک مولکول هموگلوبین می گویند(جنسن[3] وفرانک 2009).مولکول هِم مسئول رنگ قرمز هموگلوبین و میوگلوبین است ویک اتم آهن دو ظرفیتی در مرکز آن قرار گرفته است. اگر اتم آهن دو ظرفیتی(Fe²+) به آهن سه ظرفیتی(Fe³+) اکسید شود، عملکرد مولکول از بین خواهد رفت(پین وهمکاران [4]1985). در مولکول هِم هر اتم آهن فرو قادر است 6 پیوند کئوردینانس(داتیو) برقرار سازد. چهار عدد از این پیوندها با اتم های نیتروژن موجود در حلقه پورفیرین برقرار می شود، که همگی در یک سطح قرار دارند. پیوندهای پنجم وششم نیز در بالا و پایین این سطح قرار دارند. پیوند پنجم بین آهن و نیتروژن یکی از اسیدهای آمینه گلوبین و پیوند ششم بین آهن و مولکول اکسیژن برقرار می شود. بدیهی است در صورتیکه هموگلوبین، اکسیژن خود را از دست بدهد، پیوند ششم وجود نخواهد داشت (لینبرگ [5]وهمکاران،1998)( شکل 1-1). هر مولکول هِم قادر است یک مولکول اکسیژن را جابجا کند، لذا هر مولکول هموگلوبین توانایی حمل چهار مولکول اکسیژن را داراست ( لینبرگ وهمکاران،1998 ).

 

شکل1-1:زنجیره های گلوبین ومولکول هم درهموگلوبین انسانی (پروتز ،1960).

1ـ1ـ3 بیان تکوینی هموگلوبین

تجزیه وتحلیل هموگلوبین جنین انسان مشخص کردکه اساسا هموگلوبین جنینی ازیک هموگلوبین باتفاوت حرکت الکتروفورزی نسبت به هموگلوبین طبیعی تشکیل شده است که هموگلوبین جنینی یاHbF نامیده می شود. آنالیز متعاقب نشان داد کهHbF تترامری ازدوزنجیره -α گلوبین ودوزنجیره پلی پپتیدی دیگراست که توالی آن شبیه زنجیره-β گلوبین بوده وگاما(γ) نامیده می شود.HbF حدود50 درصدازهموگلوبین خون بالغین طبیعی راتشکیل می دهد(بوسالیس[6] وهمکاران ،2011).

ژن های گلوبین انسانی در دو دوره زمانی توسعه می یابد. از دوره رویانی(ε) تادوره نوزادی(γ) و از دوره نوزادی(γ) تادوره بلوغ گلوبین می باشد.

فعال شدن هموگلوبین جنینی(HbF) دربزرگسالان یکی ازاستراتژی های موثربرای درمان بیماری سلول داسی شکل وبتاتالاسمی است که به عنوان افزایش سطح هموگلوبین جنینی بابهبود علائم دربیماران مبتلابه هموگلوبینوپاتی همراه است.

درانسان سالم هشت نوع مختلف ازهموگلوبین درطی مراحل مختلف رویانی،نوزادی وبلوغ بیان می شود. (شکل 1-2) که این نشان دهنده مدل عمده ای از زیست شناسی تکاملی است که توسط تعویض وخاموش وروشن شدن ژن های مختلف گلوبین بیان می شوند(کاپیلینی[7] وهمکاران ،2009).

شکل1-2: بیان هشت نوع مختلف هموگلوبین درطی مراحل مختلف رویانی، نوزاد ی وبلوغ ازهموگلوبین(کاپیلینی ،2009).

هموگلوبین بالغین (HbA) دارای دوزنجیره آلفاگلوبین و دو زنجیره بتاگلوبین (α2 β2) می باشد. HbA قبل ازهفته 8 تا 10 حاملگی قابل ردیابی نیست، ولی بعدازماه سوم حاملگی، 4 تا 13 درصدهموگلوبین، هموگلوبین از نوع HbA است درحالیکه هموگلوبین جنینی(HbF) دارای دوزنجیره آلفاگلوبین ودوزنجیره گاماگلوبین   (α2 γ2) است. هموگلوبین جنینی ازاوایل دوره رویانی قابل مشاهده است و سنتزآن به طورسریع افزایش می یابد. بطوریکه درهفته هشتم حاملگی، حداقل 90 درصد هموگلوبین ازاین نوع می باشد ودرطی دوران جنینی و نوزادی به شکل غالب باقی می ماند(مانتووانی[8] وهمکاران، 1988).

تغییر HbF به HbAدرهفته های اول زندگی اتفاق می افتد بطوریکه مقدار HbF تا ششمین ماه پس ازتولد به حدود 3% درصدکل هموگلوبین کاهش می یابد و پس ازیک سالگی به کمتراز 2 % می رسد. شروع اختلالات بتاتالاسمی معمولا تا هنگام جایگزینی تولید گلوبین بتا به جای گامایعنی چند ماه پس ازتولد آشکار نمی شود )مانتووانی وهمکاران، 1988).

بررسی هموگلوبین جنینی درمراحل اولیه بارداری نشانگر وجود چند فرم مختلف هموگلوبین رویانی، به نامهایHb گاورI ،Hb گاور IIپورتلند رانشان میدادکه درزمان های مختلف حاملگی درمقادیرمتفاوت تولیدمی شوند(نصیری، 1389). بررسی های بعدی نشان دادکه این هموگلوبین های متفاوت که درطی تکوین به طور موقتی تولید می شوند درحقیقت تترامرهایی ازترکیب های مختلف زنجیره های گلوبینα وشبه α ی زتا یاشبه β ی γ یا اپسیلون(ε) هستند(نصیری[9]، 1389) (جدول 1-1).

جدول 1-1: میزان هموگلوبین های انسانی درطی دوران مختلف زندگی(نصیری ،1389).

به جز بیان موقتی زنجیره زتا دراوایل زندگی رویانی، ژن زنجیره –αگلوبین درطول تکوین بیان می شود. به طور مشابه بیان زنجیره-ε گلوبین درابتدای زندگی روی می دهد. بیان زنجیره γ درطی زندگی جنینی اتفاق می­افتد که با افزایش سطوح بیان زنجیره –β گلوبین به سمت انتهای دوران جنینی دنبال می شود.بیان ترتیبی این زنجیره ها،تترامرهای مختلف هموگلوبین رادرطول تکوین نتیجه می­دهد(نصیری، 1389).

1ـ1ـ4 ساختمان زنجیره گلوبین

تعیین توالی های اسیدآمینه های پلی پپتیدهای گلوبین های مختلف دردهه 1960 توسط محققین مختلف انجام گرفت و نشان داد که زنجیره –α گلوبین، 141 و زنجیره β 146 اسیدآمینه طول دارد. مشخص شدکه زنجیره های آلفا و بتا یک توالی مشابه اسیدآمینه ای دارند امابه هیچ وجه همسان نیستند. آنالیزتوالی اسیدآمینه زنجیره δ نشان دادکه در 10 اسیدآمینه بازنجیره –β گلوبین فرق دارد(ودرال،2001).

زنجیره های آلفادرهمه هموگلوبین های انسانی شبیه هم می باشند. زنجیره های غیرآلفا شامل زنجیره های بتاوزنجیره های گاما γ وزنجیره های دلتا(δ) می باشد(ودرال،2001). ژن های گلوبین دردوخوشه ژنی جداگانه سنتزمی شوندکه یکی ژن های آلفاگلوبین یا شبه آلفا می باشد ودیگری مجموعه ژنی ژن بتاگلوبین می باشد (ودرال[10]،2001).

1ـ1ـ5 خوشه ژنی آلفاگلوبین

ژن های شبه آلفاگلوبین روی کروموزوم 16 کدمی شوند وترتیب آن روی ژن ازسمت سانترومربه سمت تلومربرروی بازوی کوتاه یابازویP درکروموزوم 16 بصورت می باشد. خوشه ژنی آلفاگلوبین یک منطقه حدودا 70 کیلوبازی را روی بازوی کوتاه کروموزم 16 روی باند P13.3 اشغال می کند (لیچمن [11]و همکاران، 2006) (شکل 1-3)

شکل1-3: سازماندهی خوشه ژنی آلفاگلوبین وبتاگلوبین برروی کروموزوم های 16 و 11(کاپیلینی ،2009).

1ـ1ـ6 خوشه ژنی بتاگلوبین

خوشه ژنی بتاگلوبین روی بازوی کوتاه یا بازوی Pکروموزوم 11 قراردارد. خوشه ژنی بتاگلوبین شامل ژن جنینی ε دو ژن گاما γ گلوبین و ژن های دلتا δ وبتا گلوبین می باشد. دو ژن گاماگلوبین به جز در کدون شماره 136 دربقیه اسیدآمینه­ها باهم یکسان می باشند. بنابراین، این دو ژن با دو نام Gγ که شامل گلایسین و ژن Aγ که دارای اسیدآمینه آلانین می­باشد و در دوران جنینی بیان می­شوند ازهمدیگر متمایز می­شوند (گریر[12] و همکاران،2004).

1ـ1ـ7 ناهنجاری های هموگلوبین در انسان

هموگلوبینوپاتی ها از بیماری­های وراثتی شایع در دنیا می باشند که خاورمیانه نیز از آن مستثنی نیست و در برخی نقاط خاورمیانه بیش از 10% از جمعیت، حامل یکی از این ژن های غیرطبیعی هموگلوبین هستند.

جهش ها در ژن های گلوبین باعث تشکیل پروتئین های غیر طبیعی می شوند که اصطلاحاً واریانت­های هموگلوبین نامیده می شوند (مخرجی[13] وهمکاران، 2005). درحالت طبیعی بعد از تولد، هموگلوبین A1 دارای عملکرد طبیعی و از نظر مقدار، هموگلوبین غالب دربدن است و هموگلوبین­هایی مثل A2 و F با مقادیر بسیار کمتر در کنار آن وجود دارند. مجموعه این هموگلوبین­ها، میزان هموگلوبین کامل فرد را تعیین می کنند. درحالتی که به واسطه جهش، تغییری درتوالی اسیدآمینه های هموگلوبین رخ دهد، این ساختار دیگر قادر به انجام عملکردمطلوب خود نبوده و اصطلاحاً هموگلوبینوپاتی به وجود می­آید .بسیاری ازاین هموگلوبین­های غیرطبیعی دارای میل ترکیبی بالا با اکسیژن هستند که در حاملین خود پلی سیتمی ایجاد می کنند(مارنگو[14]،2006). تاکنون 1536 نقص در ژن گلوبین شناخته شده است که بسیاری ازآنها با بررسی حرکت الکتروفورتیک برروی استات سلولز (pH:8.6) وسیترات آگار (pH:6.2) شناسایی می شوند(اولدجم،2007). در ایران هموگلوبینوپاتی­های مختلفی گزارش شده است و در حدود 5% از جمعیت کشور حامل ژن بتاتالاسمی و 1-5/0 % دیگر حاملین انواع دیگرهموگلوبینوپاتی­ها هستند (ارجمندی [15]و همکاران، 2005).

1ـ1ـ8 اختلالات هموگلوبین­های انسانی

اختلالات هموگلوبین­های انسانی را می توان دردوگروه عمده تقسیم بندی کرد:

  • واریانت های ساختمانی زنجیره گلوبین
  • بیماری های سنتززنجیره های گلوبین یا تالاسمی

1ـ1ـ9 واریانت های ساختمانی زنجیره گلوبین

در سال 1957 اینگرام نشان داد که تفاوت بین HbSو HbA در جانشینی والین به جای اسید گلوتامیک در اسیدآمینه شماره 6 درزنجیره بتا گلوبین است. از آن هنگام بیش از 300 واریانت الکتروفورزی هموگلوبین شناسایی شده اند که به دلیل انواع مختلف جهش در این پروتئین ایجاد می شوند(جدول 1-2). حدود 200 مورد از این واریانت های الکتروفورزی، جانشینی های تک اسیدآمینه های حاصل ازیک جهش نقطه ای هستند. اکثریت این ها نادر بوده و با بیماری بالینی همراه نیستند اما تعداد کمی ازآنها با بیماری همراه بوده و در جمعیت های خاصی نسبتا شایع هستند (اینگرام[16]،1957)

برخی از واریانت های هموگلوبین بابیماری همراهند، اما بسیاری ازآنها بی ضرر بوده و با عملکرد طبیعی مداخله نمی کنند و فقط در طی دوره های بررسی جمعیتی واریانت های الکتروفورزی هموگلوبین شناسایی شده اند. اما به هرحال تعدادی ازآنها به طرق مختلف باعملکرد طبیعی هموگلوبین مداخله می کنند. اگرجهش در درون زیر واحدهای گلوبین در مجاورت پاکت های هم(heme) [17]یا در نواحی تماس بین زنجیره ها رخ دهد میتواند تولید یک مولکول هموگلوبین ناپایدار کند که در گلبول قرمز خون رسوب کرده و به غشای سلولی آسیب زده و در نتیجه منجر به همولیز سلول شود. همچنین جهش ها می توانند با عملکرد طبیعی انتقال اکسیژن یا کاهش گرایش به اکسیژن منجربه تولیدیک نوع هموگلوبین گردند که درشکل احیاء شده پایدار می باشد و مت هموگلوبین (Methemoglobin[18])نامیده می­شود (نصیری،1389).

تعداد صفحه :65

قیمت : چهارده هزار تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود به شما نشان داده می شود

و به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09124404335        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

شماره کارت :  6037997263131360 بانک ملی به نام محمد علی رودسرابی

11

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید