پایان نامه ارشد رشته زیست شناسی : بررسی باکتری سالمونلا تیفی در سالاد به وسیله روش LAMP-PCR

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته  زیست شناسی گرایش: میکروبیولوژی

با عنوان : بررسی باکتری سالمونلا تیفی در سالاد به وسیله روش LAMP-PCR

در ادامه مطلب می توانید تکه هایی از ابتدای این پایان نامه را بخوانید

و در صورت نیاز به متن کامل آن می توانید از لینک پرداخت و دانلود آنی برای خرید این پایان نامه اقدام نمائید.

دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
دانشکده: علوم پایه، گروه زیست شناسی
پایان¬نامۀ کارشناسی ارشد (M.Sc)
گرایش: میکروبیولوژی
عنوان
بررسی باکتری سالمونلا تیفی در سالاد به وسیله روش LAMP-PCR
استاد راهنما:
دکتر مجید مقبلی حسین آبادی
استاد مشاور:
دکتر هاتف آجودانی فر

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی شود

تکه هایی از متن به عنوان نمونه : (ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

   عنوان                                                                                                                   صفحه    

         چکیدۀ فارسی …………………………………………………………………………………………………………………………….12

فصل اول: مقدمه (اهداف تحقیق) ………………………………………………………………………………………………….13

اهداف تحقیق در نگاه اجمالی………………………………………………………………………………………………………..16

فصل دوم: کلیات (سابقه و پیشینۀ تحقیق)……………………………………………………………………………………..17

1-2- مشخصات جنس سالمونلا……………………………………………………………………………………………………18

1-1-2- تاریخچه………………………………………………………………………………………………………………………18

2-1-2- خواص شکلی…………………………………………………………………………………………………………….. 19

3-1-2- خواص بیوشیمیایی………………………………………………………………………………………………………..19

4-1-2-مقاومت در برابر عوامل فیزیکی و شیمیای…………………………………………………………………………..20

5-1-2- خواص کشت…………………………………………………………………………………………………………………20

6-1-2 شرایط رشد سالمونلاها……………………………………………………………………………………………………..21

7-1-2- بقا سالمونلا……………………………………………………………………………………………………………………22

8-1-2- زیستگاه…………………………………………………………………………………………………………………………23

2-2- تاکسونومی…………………………………………………………………………………………………………………………23

1-2-2- سالمونلا تیفی…………………………………………………………………………………………………………………26

2-2-2- سالمونلا انتریتیدیس………………………………………………………………………………………………………..26

3-2-2- سالمونلا کلراسوئیس……………………………………………………………………………………………………….27

4-2-2- سالمونلا پولوروم…………………………………………………………………………………………………………….28

5-2-2- سالمونلا گالیناروم…………………………………………………………………………………………………………..28

6-2-2- سالمونلا آریزونا……………………………………………………………………………………………………………..29

7-2-2- ساختمان آنتی­ژنی………………………………………………………………………………………………………….31

8-2-2- طبقه بندی سالمونلا به منظور اهداف اپیدمیولوژیکی………………………………………………………….32

1-8-2-2- ارگانیسم­های موجب عفونت در انسان ………………………………………………………………………..32

2-8-2-2- واریته های سرولوژیکی سازگار با میزبان………………………………………………………………………32

3-8-2-2- واریته های سرولوژیکی ناسازگار…………………………………………………………………………………33

3-2- شاخص­های بیماری­زایی……………………………………………………………………………………………………..33

1-3-2- آنتی­ژن­های سطحی………………………………………………………………………………………………………..33

2-3-2-تهاجم…………………………………………………………………………………………………………………………….33

3-3-2- اندو­توکسین انترو­توکسین سیتو­توکسین …………………………………………………………………………….34

4-2- بیماری­زایی و مکانیسم آن……………………………………………………………………………………………………34

1-4-2- روند بیماری­زایی……………………………………………………………………………………………………………35

2-4-2- میزان شیوع سالمونلوز در انسان……………………………………………………………………………………….35

3-4-2- عفونت­های سالمونلایی در انسان……………………………………………………………………………………..36

1-3-4-2- تب تیفوئید و تب­های روده­ای……………………………………………………………………………………..36

2-3-4-2- سپتی­سمی…………………………………………………………………………………………………………………37

3-3-4-2- گاسترو­انتریت…………………………………………………………………………………………………………….37

4-4-2- علائم بالینی در انسان……………………………………………………………………………………………………..37

5-2- اپیدمیولوژی……………………………………………………………………………………………………………………….38

6-2- روش­های تشخیص…………………………………………………………………………………………………………….40

1-6-2- روش­های فنوتیپی…………………………………………………………………………………………………………..41

1-1-6-2- بیوتایپینگ………………………………………………………………………………………………………………..41

2-1-6-2- سروتایپینگ……………………………………………………………………………………………………………….42

3-1-6-2- روش­های ایمنولوژیک………………………………………………………………………………………………..42

1-3-1-6-2- الایزا…………………………………………………………………………………………………………………….43

2-3-1-6-2- IMS…………………………………………………………………………………………………………………..44

2-6-2- روش­های ژنوتیپی………………………………………………………………………………………………………….44

1-2-6-2- روش واکنش زنجیره ایی پلیمراز PCR)) …………………………………………………………………. 45

2-2-6-2- multiplex PCR……………………………………………………………………………………………………47

3-2-6-2- real-time PCR……………………………………………………………………………………………..47

4-2-6-2- روش تکثیر هم دمای وابسته به حلقه LAMP………………………………………………………………48

1-4-2-6-2- پرایمرهای LAMP………………………………………………………………………………………………..49

2-4-2-6-2- مکانیسم واکنش LAMP……………………………………………………………………………………….51

3-4-2-6-2- مشخصات روش LAMP………………………………………………………………………………………56

4-4-2-6-2- مواد لازم برای انجام واکنش LAMP………………………………………………………………………57

5-4-2-6-2- ارزیابی محصولات LAMP……………………………………………………………………………………60

6-4-2-6-2- مکانیسم تشکیل کدورت در واکنش LAMP…………………………………………………………….61

7-4-2-6-2- مزایای روش LAMP…………………………………………………………………………………………….62

7-2 مطالعات آزمایشگاهی…………………………………………………………………………………………………………….63

1-7-2- مطالعه بر روی سویه­های سالمونلا به روش الایزا……………………………………………………………….63

2-7-2- مطالعه بر روی سویه­های سالمونلا به روش PCR………………………………………………………………65

3-7-2- مطالعه بر روی سویه­های سالمونلا به روش LAMP…………………………………………………………..70

فصل سوم (مواد و روش ها)…………………………………………………………………………………………………………75

1-3 وسایل مورد استفاده………………………………………………………………………………………………………………76

2-3- مواد مورد استفاده ………………………………………………………………………………………………………………77

3-3- رنگ آمیزی گرم………………………………………………………………………………………………………………..79

4-3- تستهای بیوشیمیایی……………………………………………………………………………………………………………79

1-4-3- تست سیمون سیترات…………………………………………………………………………………………………….81

2-4-3- تست تریپل شوگر ایرون آگار(TSI) ………………………………………………………………………………81

3-4-3- تست SIM…………………………………………………………………………………………………………………82

4-4-3- تست اوره …………………………………………………………………………………………………………………..82

5-3- روش تهیۀ گلسیرول استوک از باکتری­ مورد نظر…………………………………………………………………..83

6-3- روش استخراج DNA ……………………………………………………………………………………………………..83

1-6-3- طرز تهیۀ محلول­های مورد نیاز برای استخراج DNA………………………………………………………..84

2-6-3- مراحل استخراج DNA …………………………………………………………………………………………………84

7-3- تعیین غلظت DNA با دستگاه اسپکتروفتومتر……………………………………………………………………….86

8-3- الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………..87

1-8-3- طرز تهیه ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………88

2-8-3- طرز تهیۀ بافر (1X)TBE……………………………………………………………………………………………….88

9-3- واکنش PCR ……………………………………………………………………………………………………………………89

1-9-3- اجزا واکنش PCR………………………………………………………………………………………………………….91

2-9-3- روش انجام واکنش PCR با آنزیم SmarTaq DNA Polymerase……………………………….93

10-3- واکنش LAMP………………………………………………………………………………………………………………94

1-10-3- روش انجام واکنشLAMP …………………………………………………………………………………………95

11-3- آلوده سازی سس مایونز با باکتری مورد نظر………………………………………………………………………..96

12-3- آلوده سازی سالاد سبزیجات با باکتری مورد نظر…………………………………………………………………..97

13-3- تهیه پورپلیت و شمارش باکتری­ها………………………………………………………………………………………98

1-13-3 تهیه رقت……………………………………………………………………………………………………………………..98

2-14-3- کشت سطحی………………………………………………………………………………………………………………99

2-14-3- کشت پورپلیت…………………………………………………………………………………………………………….99

3-13-3 شمارش باکتری­ها…………………………………………………………………………………………………………..99

فصل چهارم (نتایج)……………………………………………………………………………………………………………………100

1-4- رنگ آمیزی گرم از باکتری……………………………………………………………………………………………….101

2-4- نتایج کشت نمونه ها روی محیط اختصاصی shigellasalmonella agar………………………101

2-4- تست­های بیوشیمیایی……………………………………………………………………………………………………..102

1-3-4- تست اوره………………………………………………………………………………………………………………….102

2-3-4- تست سیمون سیترات…………………………………………………………………………………………………..103

3-3-4 تست TSI ……………………………………………………………………………………………………………………104

4-3-4 تست SIM……………………………………………………………………………………………………………………105

5-3-4 تست متیل رد ……………………………………………………………………………………………………………….106

4-4- استخراج DNA …………………………………………………………………………………………………………….107

5-4- PCR………………………………………………………………………………………………………………………………108

1-5-4- حد تشخیص PCR………………………………………………………………………………………………………109

6-4- LAMP ……………………………………………………………………………………………………………………….110

1-6-4 حد تشخیص LAMP………………………………………………………………………………………………….112

فصل پنجم (بحث)……………………………………………………………………………………………………………………113

نتیجه­گیری………………………………………………………………………………………………………………………………..121

منابع و ماخذ……………………………………………………………………………………………………………………………..122

چکیده

سالمونلا باکتری گرم منفی، متحرک و باسیلی شکل است که خصوصیات عمومی خانواده انتروباکتریاسه را دارا می‌باشد. سالمونلا و سروتیپ‌های آن منبع مهم آلودگی غذاهای انسانی و عامل پاتوژن بسیار قوی و بیماری­زا در انسان­هاست. امروزه بیش از 2450 سروتیپ سالمونلا شناسایی شده است که برخی از این سروتیپ‌ها عامل بیماری‌هایی از قبیل تب تیفوئید و انتروکولیک در انسان می‌باشند. بیماری­های ناشی از این عامل یک معضل بزرگ بهداشتی در جهان به خصوص در کشورهای در حال توسعه از جمله کشور ما می باشد. بنابراین تشخیص سریع، دقیق و به موقع آن برای جلوگیری از اپیدمی و عوارض مخرب این باکتری ضروری به­نظر می­رسد.

روش­های مختلفی برای جداسازی باکتری سالمونلا از نمونه‌های محیطی وجود دارد که شامل: روش‌های کشت سنتی و بیوشیمیایی، سرولوژیکی و مولکولی (از جمله PCR) است. تمام این روش­ها به زمان طولانی، تعداد زیاد باکتری در نمونه اولیه، تجهیزات گران­قیمت آزمایشگاهی و به افراد متخصص در این زمینه نیاز دارند.

هدف از این مطالعه بررسی کارایی روش نوین تشخیص مولکولی LAMP در تشخیص عامل عفونی سالمونلا تیفی می­باشد. بررسی نتایج در تشخیص مولکولی سالمونلاها نشان داد که روش LAMP روشی سریع، ارزان و اختصاصی است و به­جای دستگاه­های گران­قیمت PCR و برنامه چرخه حرارتی چند دمایی آن با استفاده از یک بلوک حرارتی بسیار ساده و ارزان و در یک دمای واحد 60 درجه سانتی­گراد و همچنین مشاهده کدورت حاصل از فرایند تکثیر ژن­ها در زمان کوتاه­تری به تشخیص اختصاصی این باکتری سالمونلا پرداخت.

این روش می تواند جهت تشخیص مولکولی سریع، دقیق و ارزان با کاربرد گسترده در آزمایشگاه­های تشخیصی و بخصوص تشخیص عوامل عفونی در آزمایشگاه­های مناطق محروم و آزمایشگاه­های سیار مورد استفاده قرار گیرد.

واژه های کلیدی : سالمونلا، تشخیص مولکولی، PCR، LAMP

مقدمه

اعضای جنس سالمونلا، باکتری گرم منفی، میله­ایی، بی­هوازی اختیاری و بدون اسپور هستند. از آنجا که جایگاه اصلی و طبیعی این باکتری‌ها روده انسان و حیوانات می‌باشد اصطلاحاً آنها را باسیل‌های روده‌ای یا انتریک می‌نامند. از لحاظ شرایط رشد این میکروارگانیسم‌ها باکتری‌های انعطاف‌پذیری بوده و به آسانی با شرایط محیطی خود را هماهنگ می‌کنند این جنس از میکروارگانیسم‌ها به حرارت حساس‌اند. در درجه حرارت‌های پائین امکان بقای آنها بیشتر است .(Connie & Manuselis, 2000)

     اکثر سروتیپ‌های سالمونلا پاتوژن‌های بالقوه برای انسان و بسیاری از حیوانات می‌باشند. این باکتری‌ها در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از پستانداران و پرندگان و خزندگان و ماهی‌ها سیطره پیدا کرده، بسته به سروتیپ، شرایط و عوامل متعدد میزبانی، بیماری­هایی با نشانه‌های گوناگون و عوارض متفاوت ایجاد می‌کنند .(Merchant & Pocker, 1983)از جمله باکتری­های روده­ایی­ هستند که موجب بیماری تب تیفوئید(حصبه)، تب شبه حصبه و بیماری­های ناشی از مواد غذائی در انسان می­گردند(Jay et al., 2005).

     بیماری­های ناشی از آلودگی مواد غذائی ناشی از سالمونلا را non typhoidal نامیده­اند. سالمونلا به­طور گسترده­­ایی در محیط زیست از قبیل آب، خاک و مدفوع حیوانات توزیع شده است (Cidrp, 2009). باکتری معمولاً از طریق مدفوع انسان و یا دام دفع شده و باعث آلودگی آب و غذا و محیط می‌گردد. مواد غذائی مانند گوشت، تخم­مرغ، مرغ، سس مایونز، سبزیجات و غیره ،از ناقل­های اولیه عفونت سالمونلا به انسان هستند(Dolye & Beuchat, 2007)..

   سالمونلای غیر­تیفوئیدی علت اصلی بیماری­های ناشی از مواد غذائی در سراسر جهان است. که بر­آورد شده که حدود 4/1 میلیون مورد در سال مورد عفونت غذائی سالمونلا قرار می­گیرند(Mead et al., 1999).

از این­رو شناخت و تشخیص به موقع سالمونلا از اهمیت خاصی برخوردار است. با ذکر تمامی این موارد به نظر می‌رسد تشخیص به موقع و کنترل باکتری از وظایف مهم آزمایشگاه‌های میکروب‌شناسی است. امروزه از 3 روش رایج به تشخیص باکتری می‌پردازند:

ـ روش‌های کشت سنتی و آزمایشات بیوشیمیایی.

ـ روش‌های سرولوژیکی.

ـ روش‌های مولکولی.

     برای تشخیص استفاده از روش­های سنتی مبتنی بر محیط کشت قابل قبول است ولی وقت­گیر است و برای تایید جواب نهایی چند روز به­طول می­انجامد .(Andrews & Hammack, 2007) علاوه­بر این، روش­های ایمنولوژیک مانند الایزا وIMS نیز برای شناسائی سالمونلا توسه یافته­اند.

. (Mansfield & Forsythe, 2000 ; FAVRIN , 2001) با این­حال اختصایت کم و هزینه­های بالا، استفاده ازین روش­ها را محدود کرده است. اخیرا روش­های مولکولی مانند PCR و real time PCR به­طور گسترده در شناسائی سالمونلا استفاده می­شوند که روش­هایی کارآمد و حساس هستند.

Krascsenicsova et al., 2008) ; Eriksson & Aspan, 2007).

     با این­حال این روش­ها نیازمند سیکل حرارتی اختصاصی و دستگاه­های گران­قیمت­اند. از­این­رو نیاز به یک روش دقیق، حساس، آسان و به­صرفه­تر است. در سال 200 یک گروه ژاپنی یک روش تشخیص مولکولی به نام LAMP را معرفی کردند .(Notomi et al., 2000)از آن زمان روش LAMP به عنوان یک روش اختصاصی، حساس و سریع برای شناسائی پاتوژن­های ناشی از مواد غذائی مورد استفاده است. یک روش ساده، بدون نیاز به سیکل حرارتی اختصاصی و دستگاه­های گران­قیمت و به آسانی قابل اجرا است(Hara-Kudo et al., 2005; Notomi et al., 2000).

     هدف این تحقیق شناسائی باکتری سالمونلا تیفی در سالاد سبزیجات و سس مایونز آلوده با استفاده از روش LAMP، به­عنوان روشی سریع، حساس و اختصاصی می­باشد.

اهداف تحقیق در نگاه اجمالی

  1. طراحی و بهینه­سازی روش LAMP بر اساس ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی
  2. تعیین حد حساسیت روش PCR و LAMP به روی ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی
  3. مقایسه دو روش PCR و LAM
  • مشخصات جنس سالمونلا

1-1-2- تاریخچه

در سال 1885 یک دامپزشک آمریکائی به نام دانیل المر سالمون برای اولین بار این باکتری را از خوک جدا کرد وآن را باسیلوس کلرا­سوئیس[1] نامید. در سال 1888 جرم دیگری توسط گارتنر از فردی که در اثر گاستروانتریت ناشی از مصرف گوشت نپخته مرده بود جدا شد و آن­را باسیلوس انتریتیدیس نامید که بعداً سالمونلا انتریتیدیس خوانده شد. در سال 1900 خواص این باکتری توسط فردی به نام لینیر به­طور رسمی تصویب گردید. از آنجا که این ارگانیسم ها شبیه به باکتری های جدا شده توسط سالمون بودند، به همین جهت به افتخار کاشف اولیه این باکتری سالمونلا[2] نامیدند(Roumagnac et al., 2006).

     در فاصله بین سال­های 1925ـ1900 بزرگ­ترین رویداد در کشف سرولوژیکی آنتی‌ژن‌های سوماتیک و فلاژلا در مورد گروه سالمونلا بوسیله لیگنیرز انجام شد. در سال 1926 ترکیبات پادگنی سالمونلا طبقه‌بندی گردید و جدولی به نام جدول کافمن ـ وایت ایجاد شد. در حال حاضر این جدول دارای حدود 2500 سروتیپ است (Bhatia & Nabb , 1980) .

     سالمونلا بطور گسترده در طبیعت توزیع شده است مانند آب آلوده، خاک حاوی مدفوع حیوانات و غیره. به طور عمده این باکتری­ها در روده­ی حیوانات ساکن است و مخزن اصلی آلودگی مرغ، تخم مرغ، دام، حیوانات خانگی و خزندگان است(Cidrp, 2009).

 2-1-2- خواص شکلی

اعضای جنس سالمونلا باکتری­های میله­ای شکل و اندازه­ی آن 5-2 ´5/1-7 /. میکرون بوده است.گرم منفی، بدون اسپور و متعلق به خانواده­ی انتروباکتریاسه­اند (J. Antonio , 2009 ; Dolye & Beuchat, 2007) .. اکثر اعضای این جنس متحرک و با تاژه­ی پری­تریش­اند به­جز چند مورد استثناء مانند سالمونلا گالیناروم[3] و سالمونلا پولوروم[4] (et al., 2005 Hara-Kudo).

3-1-2- خواص بیوشیمیایی

اعضای این جنس قادر به تخمیر گلوکز بوده ولی از تخمیر ساکارز و لاکتوز نا­توانند. بیشتر انواع سالمونلا ها گلوکز، مالتوز، مانیتول، دولسیتول، دکسترین و سوربیتول را تخمیر می کنند و اسید و گاز بوجود می آورند. اکثر سویه­ها H2sرا از منبع سولفوری معدنی تولید کرده و تولید H2S یکی از واکنش های کلیدی در تشخیص سالمونلاها می­باشد. به استثنای سروتیپ تیفی[5] در بیشتر موارد جدا شده از گلوکز گاز ایجاد می­کنند. در سیترات به عنوان تنها منبع کربن رشد می­کنند اما برخی از گونه ها مانند سالمونلاتیفی و سالمونلا پاراتیفی A سیترات منفی هستند Aksoy, 2004)). این باکتری اکسیداز منفی و کاتالاز مثبت بوده. از تولیدات این باکتری لیزین در کربوکسیلات، سولفات هیدروژن وارنیتین می‌باشد.

( Alcamo , 1997 ; Connie & Manuselis, 2000) .

   از دیگر ویژگیهای بیوشیمیایی این است که اکثر سالمونلاها عدم تولید اندول، عدم تولید آنزیم‌های اوره آز،   لیپاز، دزاکسی ریبونوکلئاز، فنیل‌آلانین و تریپتوفان دآمیناز، دکربوکسیلاسیون اسیدهای آمینه لیزین، اورنیتین و آرژنین، واکنش مثبت در آزمایش متیل‌رد(MR) و واکنش منفی در آزمایش وژس ـ پروسکوئر (VP) مثبت می‌باشد.( (Alcamo , 1997 ; Dolye & Beuchat , 2007.

 4-1-2- مقاومت در برابر عوامل فیزیکی و شیمیایی

این باکتری روی محیط کشت ماهها زنده می­مانند. حرارت 60 درجه را 15 تا 20 دقیقه تحمل می­کنند، سالمونلاها مدت 13 ماه در لاشه­های آلوده نگهداری شده در یخچال، 120 روز درآب، 280 روز در خاک باغچه و مدت بسیار طولانی در شیرخشک­های بدون چربی و موادغذایی دارای تخم مرغ زنده می­مانند. سالمونلاها نسبت به سرما مقاوم بوده و مدت3 ماه در برف و یخ زنده مانده واز این طریق می­توانند اپیدمی به­وجود آورند. کلرامنفیکل استرپتومیسین و بسیاری از آنتی بیوتیک های وسیع الطیف بر آن موثرند پنی سیلین بر آن کاملا بی­اثر است. سالمونلاها همچنین نسبت به املاح صفراوی مقاومند وبه همین دلیل از این مواد نیز علاوه بر رنگ­ها در تهیه محیط‌های غنی‌کننده استفاده می‌کنند Aksoy, 2004)).

 5-1-2- خواص کشت

اعضای این جنس هوازی بی­هوازی اختیاری می­باشند. مزوفیل بوده و رشد بهینه­ی آن در دمای 37درجه است.با این­حال برخی از سالمونلا­هادر شرایط شدید زیست محیطی مانند درجه حرارت بالای 54 درجه و سرمای 4-2 درجه را تحمل کنند. pH مناسب برای رشد آن 5/7-5/ 6 می باشد ولی pH حدود 9- 5/4  را می تواند تحمل کند و اگر pH پائین­تر از 4 برود باعث از بین رفتن میکرو­ارگانیسم می­شود. pH بیشتر از 9 صرفا از رشد آن جلوگیری می­کند. غلظت نمک 3/ 5 % بالاتر عاملی در جهت جلوگیری از رشد و تکثیر باکتری است (Jay et al., 2005 ; Doyle.M, 2007).

     اکثر سالمونلاها در روی آگار مغذی بعد از 24 ساعت پرگنه هایی به قطر 3-2 میلی متر و به رنگ سفید، خاکستری، مرطوب ،کروی، مسطح، برجسته و صاف ایجاد می کنند. اندازه و درجه کدورت پرگنه ها به نوع سروتیپ بستگی دارد. سالمونلاها در محیط های مایع نظیر آبگوشت مغذی و آب پپتونه رشد زیادی دارند Jay et al., 2005)).

     انواع محیط‌های غنی کننده می‌توان به آبگوشت تتراتیونات آبگوشت سلنیت F، آبگوشت را پاپورت (حاوی کلریدمنیزیم و سبزمالاشیت) و آبگوشت سلنیت سیستین اشاره کرده معمولاً بعد از 24ـ18 ساعت از محیط‌های غنی کننده روی محیط‌های انتخابی جامد کشت می‌دهند. از محیط‌های انتخابی و تفریقی می‌توان به محیط مک‌کانکی و محیط سالمونلا ـ شیگلا، محیط سبز درخشان، محیط آهن لیزین‌دار، محیط داکسی کلات سیترات یا محیط لیفسون(DCA)، محیط هکتوئن و محیط داکسی کلات ـ لیزین ـ گزیلور اشاره کرد. محیط بیسموت سولفات آگار، نیز به عنوان محیط انتخابی برای جداسازی سالمونلا مورد استفاده قرار می‌گیرد چرا که قدرت انتخابگری این محیط بالاست. این باکتری‌ها معمولاً کربوهیدرات را با تولید اسید و گاز تخمیر می‌کنند.

. (D’ Aoust , 1991 ; D’ Aoust , 1998 ; Connie & Manuselis, 2000 ; Ferretti , 2001)

6-1-2 شرایط رشد سالمونلاها

سالمونلاها قادرند در محیط‌های ساده آزمایشگاهی رشد نمایند و از ترکیبات ساده کربن‌دار به عنوان منبع کربن و انرژی و از تعداد زیادی از ترکیبات ازت به عنوان منبع نیتروژن استفاده کنند (D’Aoust , 1998).

اکثر سالمونلاها پروتوتروف بوده و در میحط حداقل نمک با یک منبع کربن مناسب و یا محیط حداقل آمونیوم ـ گلوکز توانایی رشد دارند .(Morse, 1988)اکثر سویه‌های سالمونلاتیفی جهت رشد احتیاج به اسید آمینه تریپتوفان دارند. رشد سالمونلاها در دامنه حرارتی 5 تا 47 درجه است ولی دمای اپتیمم 37 درجه است .(D’ Aoust , 1991)

     بعضی از گونه‌های سالمونلا درجه حرارت‌های بالاتر از c ْ54 را نیز تحمل می‌کنند و عده‌ای دیگر خواص سرما دوستی را بوسیله رشد کردن در c ْ4ـ2 از خود نشان دادند. دردرجه حرارت‌های پائین امکان رشد و بقای سالمونلا بیشتر است. گزارش شده که سالمونلاها نسبت به خشکی حساسند از این­رو انتشار آن­ها از طریق گرد و غبار و ذرات خشک کمتر از آب و مواد غذایی مرطوب است. بقاء سالمونلاها به طور نسبی به درجه حرارت محیط وابسته است .(Davis , 1996) به طوریکه در 55 درجه سانتی‌گراد در عرض یک ساعت و در 60 درجه در مدت 15 دقیقه نابود می‌شوند.

     پاستوریزاسیون شیر باعث از بین رفتن سالمونلاها می‌گردد. شیر به مدت 3ـ2 ثانیه در 66 درجه سانتی‌گراد، تخم‌مرغ به مدت 10 دقیقه در 55 درجه سانتی‌گراد و گوشت به مدت 10ـ15 دقیقه در 65 درجه سانتی‌گراد معمولاً عاری از سالمونلای زنده خواهند شد .(Alcamo , 1997)

   رشد سالمونلا بوسله منابع مختلف کربن و نیتروژن تنظیم می‌شود. اندازه باکتری و میزان متوسط اجسام نوکلئوزیدی هر دو مستقیماً به میزان رشد وابسته‌اند. حساسترین معرف تغییر در میزان رشد، RNA ریبوزومی است. به جز مواردی که میزان رشد بسیارپائین است، میزان ریبوزوم‌ها درهر میلی‌گرم پروتئین‌ با میزان رشد متناسب است. به دنبال افزایش سنتز RNA به آرامی میزان سنتز پروتئین و DNA نیز افزایش می‌یابد. این مسأله به دلیل نقش تنظیمی RNA در سنتز ترکیبات یافته‌ای است. آب نمک با غلظت بیش از 10% اثر کشندگی روی باکتری سالمونلا دارد   .(D’ Aoust , 1991 ; Quinn , 1994)

 7-1-2- بقا سالمونلا

بقای سالمونلاها در محیط تحت‌تأثیر عوامل مختلفی است. گزارش شده که سالمونلا دابلین در زمستان حداقل به مدت 73 روز و در تابستان 119 روز در مدفوع زنده می‌ماند. بنا به تحقیقات بقا سالمونلاتیفی موریوم در چراگاه و خاک و بسته حدود 200 روز تخمین زده شده است(.(Connie & Manuselis , 2000

بقاء سالمونلاها به طور نسبی به درجه حرارت محیط وابسته است به طوری‌که سالمونلاتیفی موریوم و سالمونلا کلراسیس در c ْ29 به ترتیب 4 و 9 روز و در c ْ60 به مدت 25 و 38 روز زنده می‌مانند. مقاومت به حرارت در مورد سالمونلایی که در یک محیط غنی از مواد مغذی رشد می‌کنند و یا در محیطی با aw کم هستند بیشتر از آنهایی است که در یک محیط فقیرند. بررسی‌ها نشان داده که اگر سالمونلا تیفی موریوم در معرض محیط اسیدی ملایم (6 – 5/5) قرار گیرد سلول تا pH > 5/4 را تحمل می‌کند Foster , 1995)).

 8-1-2- زیستگاه

سروتیپ­های جنس سالمونلا از مهم­ترین باکتری­های میله­ای گرم منفی، عامل التهاب ­های روده­ای حاصل از مواد غذائی است که با منشا انسانى و حیوانى پراکنش وسیعى در طبیعت دارند. زیستگاه اصلی سروتیپ­های سالمونلا، روده جانورانی همانند پرندگان، خزندگان، جانوران مزرعه­ا ی و انسان می­باشد .می­تواند از ماهی و لاک­پشت نیز به­طور مستقیم انتقال یابد. انتشار این باکتری از حیوان به حیوان دیگر و استفاده از مواد غذایی دامی آلوده به سالمونلا توجیه کننده این مطلب است که حیوانات به عنوان مخزن باکتری می­باشند MIRZAIE,2010)).

   این ارگانیسم­ها از طریق مدفوع دفع شده و مى­توانند موجب آلوده شدن آب­­هاگردند. مصرف آب­های آلوده و مواد غذایی آلوده شده توسط حشرات یا دیگر واسطه­ها به­وسیله انسان و سایر جانوران موجب تکرار چرخه آلودگى مى­شود. تکرار این چرخه از طریق تبادلات بین­المللی فرآورده­های جانوری و خوراک دام عامل عمده انتشار جهانی سالمونلوزیس است .

تعداد صفحه :128

قیمت : چهارده هزار تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود به شما نشان داده می شود

و به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09124404335        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

شماره کارت :  6037997263131360 بانک ملی به نام محمد علی رودسرابی

11

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید