پایان نامه ارشد رشته زیست شناسی : تشخیص برخی از سرووارهای سالمونلا انتریکا به کمک Multiplex PCR

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی

با عنوان :  تشخیص برخی از سرووارهای سالمونلا انتریکا به کمک Multiplex PCR

در ادامه مطلب می توانید تکه هایی از ابتدای این پایان نامه را بخوانید

و در صورت نیاز به متن کامل آن می توانید از لینک پرداخت و دانلود آنی برای خرید این پایان نامه اقدام نمائید.

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد دامغان

دانشکده علوم پایه

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی

گرایش میکروبیولوژی

عنوان:

تشخیص برخی از سرووارهای سالمونلا انتریکا به کمک Multiplex PCR در موارد اسهالی ارجاعی به بیمارستان­های سبزوار

استاد راهنما:

دکتر علی اکبر جنت آبادی

استاد مشاور:

دکتررضا نظام زاده

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی شودتکه هایی از متن به عنوان نمونه : (ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)چکیده...............................................................................................................................................2فصل اول- مقدمه                                                                   مقدمه وهدف................................................................................................................................4فصل دوم-مروری بر تحقیقات گذشته                                           2-1- خصوصیات سالمونلا...........................................................................................................8          2-1-1- تاریخچه............................................................................................................................8          2-1-2- طبقه بندی.........................................................................................................................9          2-1-3- خصوصیات ماکروسکوپیک و میکروسکوپیک...............................................................10        2-1-4- حساسیت به مواد شیمیایی..............................................................................................12        2-1-5- ساختار پادگنی سالمونلا................................................................................................12        2-1-6- روش های طبقه بندی....................................................................................................14        2-1-7- شرایط رشد سالمونلا.....................................................................................................15         2-1-8- بقا سالمونلا....................................................................................................................17        2-1-9- منشا سالمونلا.................................................................................................................20        2-2- آلودگی در انسان................................................................................................................21        2-2-1- میزان شیوع سالمونلوز در انسان....................................................................................222-2-2- علائم سالمونلوز در انسان.............................................................................................232-2-3- دوز آلوده کننده.............................................................................................................252-2-4- پیشگیری.......................................................................................................................252-3- سالمونلوز در حیوانات......................................................................................................262-4- سالمونلوز در پرندگان.......................................................................................................272-4-1- آلودگی در طیور............................................................................................................272-4-2- میزان شیوع...................................................................................................................282-5- روش های تشخیص سالمونلا............................................................................................292-5-1- روش های کشت.........................................................................................................292-5-2- روش سرولوژیکی.......................................................................................................302-5-3- روش الایزا................................................................................................................ 302-5-4- روش آگلوتیناسیون به کمک لاتکس......................................................................... 312-5-5-1-روشPCR.............................................................................................................. 31        2-5-5-2-   جستجو وآنالیز محصولاتPCR......................................................................... 312-5-5-3- بهبود حساسیت و ویژگی تکثیرPCR...................................................................332-5-5-4-   اجزای PCR........................................................................................................332-5-5-5- سابقه PCR در شناسایی سالمونلا.........................................................................34فصل سوم:مواد و روش ها .......................................................................................................44           3-1- وسایل مورد استفاده........................................................................................................453-2- مواد مورد استفاده............................................................................................................463-3- گرد آوری نمونه های آزمایشی.......................................................................................463-4-1- مواد و وسایل لازم برای تهیه محیط...........................................................................463-4-2- مواد و وسایل لازم جهت کشت نمونه.......................................................................463-4-3- کشت در محیط جامد انتخابی....................................................................................473-5- آزمون های بیوشیمیایی...................................................................................................473-5-1- کشت در محیط آهن دار سه قندی.............................................................................473-5-2- آزمون اوره آز............................................................................................................ 48        3-5-3- آزمون وژس پروسکوئر..............................................................................................483-5-4- آزمون اندول.................................................................................................................493-5-5- آزمون سیترات............................................................................................................493-5-6- آزمون حرکت..............................................................................................................493-6- آزمون رنگ آمیزی گرم..................................................................................................49   3-6-1- تهیه گسترش روی لام...............................................................................................50   3-6-2- رنگ آمیزی با کریستال ویوله....................................................................................503-6-3- مرحله شستشو...........................................................................................................51   3-6-4- مرحله اضافه کردن محلول ید....................................................................................51   3-6-5- مرحله رنگ بری با استفاده از استن – الکل...............................................................51   3-6-6- رنگ آمیزی با فوشین.................................................................................................51   3-6-7- خشک کردن لام.........................................................................................................51 3-6-8-نکات مهمی که هنگام رنگ آمیزی گرم باید مورد توجه قرار گیرد ...........................51   3-7- استخراج DNA............................................................................................................52                                                                    3 -7-1-   مواد و وسایل لازم..................................................................................................523-8- آزمون PCR................................................................................................................. 52                                                                                              3-8-1- مواد و وسایل لازم....................................................................................................523-8-2- روش کار..................................................................................................................533-9- الکتروفورز محصولاتPCR..........................................................................................54                                                                  3-9-1- مواد و وسائل لازم....................................................................................................54      3-9-2- تهیه بافر 1x..............................................................................................................553-9-3- تهیه ژل آگاروز.........................................................................................................553-8-4- بارگذاری محصولات ……………………………….PCR..............................55              3-10- مشاهده باند های روی ژل..........................................................................................56                                                      3-10-1- مواد و وسایل لازم.................................................................................................56فصل چهارم :نتایج                                                                      4-1 نتایج................................................................................................................................584-2- کشت در محیط جامد انتخابی.......................................................................................584-2-1- کشت در محیط XLD ............................................................................................58                                                                            4-2-2-کشت در محیط سالمونلا شیگلا آگار.........................................................................594-3-آزمون گرم.......................................................................................................................594-4-تست های بیو شیمیایی........................................................................................................604-4-1-آزمون .TSI....................................................................................................................604-4-2-آزمون اوره آز................................................................................................................604-4-3-آزمون ..VP...............................................................................................................614-4-5-آزمون اندول...................................................................................................................614-4-6-آزمون سیترات............................................................................................................... 614-4-7-آزمون حرکت.................................................................................................................624-5-استخراج DNA.................................................................................................................634-5-1-استخراج توسط KOH 5/0 مولار.................................................................................634-6-آزمونPCR........................................................................................................................634 -7-نتایج آزمون کای دو.........................................................................................................67فصل پنجم : بحث و پیشنهادات                                                                            5-1- بحث................................................................................................................................695-2- نتیجه گیری نهایی............................................................................................................775-3-پیشنهادات.........................................................................................................................78چکیده:عفونت‌های سالمونلایی که عفونت های غذایی نامیده می‌شوند، ممکن است توسط هر یک از سرووارها ایجاد شود. معمولا باکتری عامل عفونت در ماده غذایی رشد می‌کند تا به مقدار قابل توجهی برسد. به این ترتیب احتمال عفونت افزایش یافته و موجب بروز بیماری در خانواده‌ها و گروه‌های بزرگ می‌شوند. سالمونلا و سروتیپ‌های آن منبع مهم آلودگی‌های غذایی انسان و عامل پاتوژن بسیار قوی و بیماری‌زا در انسان‌هاست. سالمونلا باکتری گرم منفی، متحرک و باسیلی شکل است که خصوصیات عمومی خانواده انتروباکتریاسه را داراست. امروزه بیش از 2450 سروتیپ سالمونلا شناسایی شده است که برخی از این سروتیپ‌ها عامل بیماری‌هایی از قبیل تب تیفوئید و انتروکولیت در انسان می‌باشند. در این مطالعه 50 نمونه مدفوع افراد مبتلا به اسهال از سطح بیمارستان‌های شهرستان سبزوار جمع‌آوری گردید و با رعایت کامل موارد بهداشتی به آزمایشگاه تخصصی دانشگاه آزاد اسلامی واحد سبزوار منتقل شدند. برای جداسازی اولیه از محیط کشت‌های بافر پپتون واتر ، سلنیت F براث ،XLD و SS آگار استفاده گردید. جهت تایید تشخیص از تست‌های بیوشیمیایی نظیر TSI و اوره آگار و VP، اندول و سیمون سیترات و حرکت استفاده شد. در مطالعه حاضر 10 مورد باکتری سالمونلا با استفاده از روش کشت میکروبی جدا شد. این در حالی است که با استفاده از روش مولکولی Multiplex PCR ، 21 مورد باکتری سالمونلا در نمونه‌ها ردیابی گردید. بنابراین می‌توان گفت که روش PCR نسبت به کشت میکروبی از دقت بالاتری برخوردار است و همچنین روش‌های سنتی کشت میکروبی اغلب زمان‌بر خسته‌کننده و پرهزینه است.واژه‌های کلیدی: سالمونلا ، Multiplex PCR ، مدفوع مقدمه و هدف:در طول دهه گذشته وقوع بیماری‌ها و عفونت های با منشا غذایی نه تنها در کشورهای در حال توسعه و با فقر بهداشتی، بلکه در کشورهای توسعه یافته و با استانداردهای بالای بهداشتی نیز رو به افزایش بوده و این در حالی است که وقوع عفونت‌ها و مسمومیت‌های غذایی اغلب گزارش نشده باقی می‌ماند و لذا تعیین آمار دقیق از میزان ابتلا خصوصاً در کشورهای درحال توسعه امکان‌پذیر نمی‌باشد. غذا می‌تواند به عنوان یک حامل، بسیاری از میکروارگانیسم‌های عامل عفونی یا غیر عفونی را در خود حمل کند که در بعضی از شرایط، رشد عامل عفونی را حمایت کرده و به عنوان ناقل فعال عمل نموده و یا تنها نقش ناقل غیرفعال را ایفا می‌نماید که در این صورت عامل عفونت در غذا رشد ننموده و یا تنها به وسیله‌ی غذا به انسان منتقل می‌شود. بیماری‌های غذایی جزء بیماری‌های روده‌ای تقسیم‌بندی می‌شوند که از نظر اهمیت در آمریکا بعد از بیماری‌های ریوی در مقام دوم قرار دارند. در یک بررسی در ایالات متحده گزارش شده که بطور مستقیم هر آمریکایی حداقل هر سال یکبار به بیماری‌های روده‌ای با علامت اسهال مبتلا می‌شوند. گفته می‌شود که این مسئله به خاطر ناسالم بودن غذای تولید شده در این کشور نیست بلکه مردم با عمل‌آوری غلط و غیربهداشتی و یا از طریق انتقال عوامل عفونی خود غذا را ناسالم می‌کنند (مهرور و همکاران،1385).برطبق مطالعات انجام شده همه ساله بیش از هزار میلیون مورد اسهال حاد در بین بچه‌های زیر پنج سال در کشورهای آمریکا، آسیا (به استثنای چین) و آمریکای لاتین اتفاق می‌افتد که به مرگ بیش از پنج میلیون نفر منجر می‌گردد. در کشورهای صنعتی مشکل کمتر از این‌هاست ولی به طور معنادار هنوز از اهمیت خاصی برخوردار است. طبق گزارش‌های موجود تنها در یک همه‌گیری آن هم در کشوری مثل آمریکا بیش از 15000 نفر در اثر مصرف شیرآلوده به سالمونلای مقاوم به آنتی‌بیوتیک مبتلا شدند. باکتری‌ها به عنوان مهم‌ترین عوامل در بروز بیماری‌های ناشی از مصرف غذا می‌باشند(اردستانی و همکاران،1386). از جمله این عوامل بیماری‌زا خانواده انتروباکتریاسه است(تاجبخش،1386). خانواده انتروباکتریاسه از تعداد زیادی باکتری گرم منفی تشکیل شده که قرابت بسیاری با هم دارند و در آب و خاک و مواد در حال فساد و گیاهان و دستگاه گوارش انسان و حیوانات و حشرات یافت می‌شوند. از آن جا که جایگاه اصلی و طبیعی این باکتری‌ها روده انسان و حیوانات می‌باشد اصطلاحاً آنها را باسیل‌های روده‌ای یا انتریک می‌نامند. باکتری‌های جنس سالمونلا گرم منفی، هوازی و بی‌هوازی اختیاری، باسیلی شکل به اندازه‌ی 5-2 × 5/1 – 7/0 میکرون هستند که خصوصیات عمومی خانواده انتروباکتریاسه را دارا می‌باشند (تاجبخش،1376).از لحاظ شرایط رشد این میکروارگانیسم‌ها باکتری‌های انعطاف‌پذیری بوده و به آسانی با شرایط محیطی خود را هماهنگ می‌کنند. این جنس از میکروارگانیسم‌ها به حرارت حساسند. در درجه حرارت‌های پائین امکان بقای آنها بیشتر است. اکثر سروتیپ‌های سالمونلا پاتوژن‌های بالقوه برای انسان و بسیاری از حیوانات می‌باشند. این باکتری در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از پستانداران و پرندگان و خزندگان و ماهی ها سیطره پیدا کرده و بسته به سروتیپ، شرایط و عوامل متعدد میزبانی ، بیماری‌هایی با نشانه‌های گوناگون و عوارض متفاوت ایجاد می‌کنند(زهرایی صالحی،1388). این باکتری‌ها معمولاً از طریق مدفوع انسان یا دام دفع شده و باعث آلودگی آب و غذا و محیط می گردند. انسان و حیوانات در بیشتر موارد در اثر مصرف این‌گونه مواد آلوده، باکتری را وارد دستگاه گوارش خود کرده و در نتیجه این گردش دهانی – مدفوعی تداوم می‌یابد(زهرایی صالحی،1388). باکتری سالمونلا انتریکا مهم‌ترین عامل در ابتلا به بیماری سالمونلوز در انسان می‌باشد به طوری که شیوع عفونت‌های سالمونلا انتریتیدیس به خصوص در دهه‌ی اخیر افزایش یافته است. فرد آلوده با سرووارهای سالمونلا انتریکا اغلب مبتلا به تب، دردهای ماهیچه‌‌های شکمی و اسهال می‌باشد. شروع این علائم از 12 ساعت تا یک هفته پس از مصرف غذای آلوده ادامه دارد. این بیماری اغلب 4 تا 7 روز به طول می‌انجامد در بسیاری از افراد بدون درمان با آنتی‌بیوتیک بهبود می‌یابند. با این حال، اسهال می‌تواند شدید و گاهی اوقات منجر به بستری شدن افراد در بیمارستان گردد. بیماری در شیرخواران، کودکان و همچنین افراد مسن شدت داشته و نگران‌کننده می‌باشد. در مواردی بیماری می‌تواند به مرگ و میر در افراد حساس منجر شود(یوسفی مشعوف و همکاران ،1380) .امروزه در آزمایشگاه‌های میکروب‌شنای از سه روش رایج جهت شناسایی و تشخیص باکتری استفاده می‌شود.1- روش کشت سنتی و بیوشیمیایی که با تهیه نمونه و تهیه محیط کشت و تشخیص باکتری استفاده می‌شود.2- روش‌ها سرولوژیکی: برپایه تشخیص آنتی‌ژن‌های تولید شده توسط باکتر (آنتی‌ژن O و H) است.3- روش‌های مولکولی: واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) یکی از رایج‌ترین روش‌های مولکولی است که بر اساس حضور ژن خاص و یا به عبارت دیگر قطعه‌ای از DNA است در این روش قطعه‌ای از ژن هدف تشکیل شده و وجود عامل پاتوژن اثبات می‌گردد. چندین ژن هدف در سویه‌های سالمونلا وجود دارد(,...,( InvA, spvC, InvB, OmpC(کارلسون و همکاران، 2004).ژن InvA که برای تهاجم باکتری سالمونلا لازم است و بوسیله آن باکتری به قسمت‌های عمقی‌تر روده نفوذ می‌کند برای جنس سالمونلا اختصاصی است(گورین و همکاران،2005).در این تحقیق که در دانشگاه آزاد اسلامی واحد سبزوار انجام گرفت بر روی نمونه‌های کلینیکی (مدفوع) با استفاده از محیط‌های اختصاصی سالمونلا و سپس با روش مولکولی Multiplex PCR به شناسایی عوامل پاتوژنی سالمونلا پرداختیم. هدف از این مطالعه ارزیابی تناسب ژن invA ،ompC و rfs به وسیله Multiplex PCR ،به عنوان روش اختصاصی برای تشخیص برخی از سرووارهای سالمونلا انتریکا در نمونه های کلینیکی (مدفوع)بود . همچنین مقایسه روشPCR با روش های کشت سنتی و اختصاصی برای تشخیص سالمونلا بود.2-1-خصوصیات سالمونلا :2-1-1-تاریخچه :بیماری های ناشی از سالمونلا در انسان و حیوانات از زمانهای قدیم وجود داشته ولی تشخیص تفریقی آن از سایر بیماری ها مشکل بوده است. در جلد اول و دوم کتاب ارزشمند تاریخ دامپزشکی و پزشکی ایران تألیف استاد گرانقدر جناب آقای دکتر حسن تاج‌بخش به بیماری حصبه، تب مُطِبِقه و تب تیفوئید اشاره شده است. در اوایل قرن 19 دو دانشمند فرانسوی به نامهای لوئی[1] و کومل[2] نشانه های بالینی و کالبدگشای تب تیفوئید را مورد بررسی قرار دادند(زهرایی صالحی،1388).در سال 1837 گرهارد[3] در اپیدمی تیفوس در فیلادلفیا دو بیماری تیفوس و تیفوئید را از هم متمایز ساخت. ادوارد جنر[4] در بین سالهای 1849ـ1851 در بریتانیا از روی تجزیه و تحلیل نشانه‌های بیماری‌های تب‌دار، تب تیفوئید را تشخیص داد(زهرایی صالحی،1388).ویلیام باد[5] در طی 1856ـ1873 نشان داد که تب تیفوئید بیماری است عفونی و از طریق مدفوع انسان و حیوانات و آب آلوده انتقال می‌یابد. در حال حاضر این باکتری به عنوان سالمونلا تیفی شناخته می‌شود. همچنین این باکتری در سال 1885 توسط فیفر[6] از مدفوع، در سال 1886 توسط هوپ[7] از ادرار و در سال 1888 توسط ویلچور[8]و فون و ون‌فوتری[9] از کیسه صفرا، در سال 1907 بوسیله کانرادی[10] از فرد مبتلایی در دوره کمون بیماری جدا گردید. در سال 1885 اسمیت و سالمون جرمی را از خوک جدا کردند. بعدها نام این جرم را سالمونلا کلراسویس گذاشتند(زاپور و دولی،2005). در سال 1888 جرم دیگری توسط گارتنر[11] از فردی که در اثر گاستروانتریت ناشی از مصرف گوشت نپخته مرده بود جدا شد و آنرا باسیلوس انتریتیدیس نامید که بعداً سالمونلا انتریتیدیس خوانده شد(آدامز و موس، 2000). لوفلر[12] در سال 1982 از بیماری مشابه تب تیفوئید در موش جرمی را جدا کرد و آنرا باسیلوس تیفی موریوم نامگذاری کرد(داویس و واری، 1996). نوبل[13] در سال 1989 و وری[14] در سال 1908 جرم مشابهی را از خوکچه هندی جدا کردند که بعداً سالمونلا تیفی موریوم نامیده شد. سالمونلاگالیناروم[15]اولین‌بار بوسیله کلین[16]در سال 1889 و سالمونلا پولوروم به وسیله رتگر[17]در سال 1900 مورد شناسایی قرار گرفت(هاوستاد ،1972). لینیر[18] در سال 1900 خواص اجرام مربوط به پاراتیفوئید B , A را مورد بررسی قرار داد و متوجه گردید که این ارگانیسم‌ها شبیه باکتری‌های جدا شده توسط سالمون هستند به همین جهت به افتخار اولین کاشف این باکتری‌ها پیشنهاد کرد که آنها را سالمونلا بنامند. دانیل سالمون پاتولوژیست بود که اولین بار سالمونلا را از روده خوک جدا کرد(تاجبخش،1382). در فاصله بین سالهای 1925ـ1900 بزرگترین رویداد در کشف سرولوژیکی آنتی‌ژن‌های سوماتیک و فلاژلا در مورد گروه سالمونلا بوسیله لیگنیرز[19] انجام شد(تاجبخش، 1385).در سال 1926 ترکیبات پادگنی سالمونلا طبقه‌بندی گردید و جدولی به نام جدول کافمن ـ وایت ایجاد شد. در حال حاضر این جدول دارای حدود 2500 سروتیپ است(کافمن، 1971) .تعداد صفحه :101قیمت : چهارده هزار تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود به شما نشان داده می شود

و به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09124404335        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید