پایان نامه ارشد کشاورزی : تعیین ترادف اپرون ار. ان. ای ریبوزومی و آنالیز فیلوژنتیکی فیتوپلاسماهای همراه با بیماری تورم جوانه بادنجان

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته کشاورزی گرایش بیماری شناسی گیاهی

با عنوان :  تعیین ترادف اپرون ار. ان. ای ریبوزومی و آنالیز فیلوژنتیکی فیتوپلاسماهای همراه با بیماری تورم جوانه بادنجان

در ادامه مطلب می توانید تکه هایی از ابتدای این پایان نامه را بخوانید

و در صورت نیاز به متن کامل آن می توانید از لینک پرداخت و دانلود آنی برای خرید این پایان نامه اقدام نمائید.

دانشگاه آزاد اسلامی اسلامی

واحد دامغان

پایان نامه جهت دریافت کارشناسی ارشد رشته بیماری شناسی گیاهی (M.Sc.)

عنوان:

تعیین ترادف اپرون ار. ان. ای ریبوزومی و آنالیز فیلوژنتیکی فیتوپلاسماهای همراه با بیماری تورم جوانه بادنجان در استان بوشهر

استاد راهنما:

دکتر محمد صالحی

استاد مشاور:

دکتر ساغر کتابچی

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی شودتکه هایی از متن به عنوان نمونه : (ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)چکیدهپیشتر بیماری تورم جوانه بادنجان و گوجه فرنگی به عنوان یک بیماری شایع و خسارتزا از استان بوشهر گزارش شده است. تحقیق مذکور بوته های آلوده بادنجان و توتون استان بوشهر متعلق به مناطق بنداروز، برازجان، بوشهر و کنگان را پس از انتقال به آزمایشگاه مرکز تحقیقات کشاورزی و منبع طبیعی فارس-زرقان مورد بررسی و مطالعه قرار داده و ذکر نموده است که جدایه های مورد مطالعه بر اساس علائم ایجاد شده در گیاه پروانش به سه گروه تقسیم می شوند. RFLP ژن ریبوزومی 16S نیز نتایج داده های بیولوژیک را تایید کرده است. پیرو تحقیق مذکور، در این تحقیق تعداد شش جدایه شامل پنج جدایه از بادنجان و یک جدایه توتون موجود بر روی گیاه پروانش انتخاب و دی.ان.ای استخراج شده از بافت­های گیاهی (نمونه های برگ پروانش) طبق روش پیشنهادی مایکسنر و همکاران (1995) در آزمایش های بعدی مورد استفاده قرار گرفتند. در آزمون PCR با بکارگیری جفت آغازگر P1/P7 ناحیه اپرون ار. ان. ای ریبوزومی جدایه های مذکور تکثیر گردید. هضم محصول PCR با آنزیم های Rsa I و Hinf I جدایه های مورد مورد تحقیق را به 3 گرو تقسیم کرد (جدای های 1،4 و 5 در یک گروه، جدایه 2 در یک گروه و جدایه 3 و 6 در گروه دیگر)، آنزیم Hae III جدایه ها را به دو گروه تقسیم کرد (1، 2، 4 و 5 در یک گروه و جدایه های 3 و6 در گروه دیگر) ولی آنزیم Alu I نتوانست مابین جدایه ها تمایز حاصل کند. قطعه­های تکثیر شده در آزمون PCR با استفاده ازIns T/A clone PCR Product Cloning Kit (MBI Fermentas) در پلاسمید PTZ57R/T وارد و در سویه DH5α باکتری Escherichia coli همسانه سازی گردید. آنالیز ترادف نوکلئوتیدی نتایج آزمون RFLP را تایید و جدایه ها را در سه گروه قرار داد. لازم به ذکر است آنالیز فیلوژنتیک ناحیه اپرون ریبوزومی گروه یک را به دو زیر گروه تقسیم کرد بطوری که جدایه 1، 4 را در یک زیر گروه و جدایه 5 در زیرگروه دیگر قرار گرفت. علاوه بر این جدایه های گروه 2 (جدایه های 3 و 6) نیز هر کدام در یک زیر گروه قرار گرفتند. البته جدایه 3 با داشتن یک جایگاه برشی اضاف تر در موقعیت 938 با آنزیم برشی Hpa II می تواند از جدایه 6 متمایز گردد.1-1- مقدمهبراساس خوش­بینانه ترین برآوردها، جمعیت جهان در پایان نیمه اول قرن بیست و یکم از مرز ده میلیارد نفر خواهد گذشت. این در حالی است که بانک جهانی در سال 1994 اعلام کرده حدود هشتاد و سه درصد از این جمعیت مربوط به کشور های در حال توسعه می باشد. بدون شک مهمترین و حیاتی ترین نیاز این جمعیت عظیم غذا و امنیت غذایی می­باشد. مطمئنا از طریق افزایش بهره وری، استفاده مناسب از وسایل و منبع تولید از جمله آب، خاک، نیروی انسانی آموزش دیده و... می­توان به تولید پایدار دست یافت و در نهایت بخشی از امنیت غذایی تامین کرد. در این مبحث حفاظت از گیاهان، کنترل آفات، بیماریها و      علف های هرز حائز اهمیت فوق العاده می­باشد. بعنوان مثال برابر تخمین وزارت کشاورزی آمریکا بیماریهای گیاهی سالانه 9.1، آفات 7.7 و علف های هرز 6.2 میلیارد دلار فقط در ایالات متحده خسارت وارد می­کنند. خسارت گیاهی ناشی از آفات و بیماری ها نه تنها در عرضه مواد غذایی در سطح ملی و بین المللی تاثیر دارد بلکه بر زندگی زارعی که گیاه را برای مصرف مستقیم خود یا حتی برای فروش کاشته است نیز تاثیر خواهد گذاشت.رده مالیکیوت­ها گروهی از پروکاریوت­های فاقد دیواره سلولی بوده که از نظر تکاملی از باکتری­های گرم مثبتی که درصد مجموع سیتوزین و گوانین پایین دارند مشتق شده اند. بعضا این گروه توانایی بیماریزایی در گیاهان را دارند. از بیمارگرهای گیاهی واقع در این گروه می توان به اسپیروپلاسماها (دارای سلول های مارپیچ، متحرک و قابل کشت) و فیتوپلاسماها (سلول های غیر مارپیچ و غیر قابل کشت) اشاره کرد (Weisburg et al. 1989). از زمان کشف فیتوپلاسماها در سال 1967 میلادی تا کنون بیش از صد ها بیماری همراه با فیتوپلاسما در بیش از 300 جنس گیاهی شناخته شده است (Lee et al., 2000, McCoy et al., 1979 and Seemuller et al., 1998).فیتوپلاسماها با نام قبلی شبه مایکوپلاسما(MLO) (IRPCM, 2004) محدود به آوند های آبکشی گیاهان میزبان و همچنین همولنف حشره ناقل می­باشند (Lee et al., 2000). این گروه از بیمارگرهای گیاهی در طبیعت توسط ناقلین مکنده که عمدتا زنجرک­های برگی(Leafhopper) بوده و متعلق به خانواده Cicadellidae می­باشند (Lee et al., 2000) با روش پایا و تکثیری (Firrao et al., 2005) گسترش پیدا می­کنند. البته در مواردی پسیل ها نیز بعنوان ناقل اینها گزارش شده اند (Lee et al., 2000). بیماری های فیتوپلاسمایی اغلب باعث عقیمی و مرگ گیاه میزبان شده و معمولا دارای خسارتی کم و بیش معادل صد در صد می باشند که این خسارت شامل کاهش کیفیت و کمیت محصول می­باشد.در ایران تاکنون پیرامون بیماری های فیتوپلاسمایی تحقیقات گستردهای انجام شده است (صالحی و همکاران 1385). یکی از بیماری های مهم فیتوپلاسمایی در ایران بیماری تورم جوانه در بادنجان، گوجه فرنگی و توتون می باشد (صالحی و ایزدپناه 1377، صالحی و همکاران 1379 و رئوفی و همکاران 1389). علائم در این بیماری شامل: گل سبزی، برگ سانی، تورم جوانه، عقیم شدن، کاهش تعداد و اندازه گل، ازدیاد جوانه های جانبی ساقه، جاروئی شدن انتهای ساقه، طویل شدن غیر معمول میانگره، ریز برگی، تغییر رنگ برگها و جوانه ها، پیچیدگی و قاشقی شده برگها، سرخشکیدگی، زوال و مرگ گیاه می­باشد (Lee et al., 2000).حدود 483 هزار هکتار از اراضی کشور سالانه (سال زراعی 85-1384) به گروه سبزی جات اختصاص داشته است. حدود نیمی از این مقدار در 7 استان خوزستان، فارس، کرمان، اصفهان، هرمزگان، آذربایجان شرقی و همدان کشت شده است. استان بوشهر در این سال با کشت حدود 75/3 درصد سبزیجات مقام 13 را به خود اختصاص داده است. از 17 هزار هکتار سطح زیر کشت در این استان حدود 14 هزار هکتار به محصول گوجه فرنگی و حدود 2 هزار هکتار به سایر سبزی جات از جمله بادنجان، فلفل و... اختصاص داشته است. علاوه بر موارد ذکر شده، استان بوشهر مقام اول تولید گوجه فرنگی خارج از فصل را در کشور به خود اختصاص داده است (آمارنامه کشاورزی 1384).بیماری تورم جوانه در گیاهان بادنجان، گوجه فرنگی و توتون یکی از مهمترین بیماری های سیفی جات می باشد (Shew and lucas1991). بیماری تورم جوانه پیشتر از مزارع ورامین-اطراف کرج (اسکندری و همکاران 1349) فارس (صالحی و همکاران 1374) استانهای اردبیل اصفهان و آذربایجان غربی (رشیدی و همکاران 1385) و خراسان (جمشیدی و همکاران 1389) گزارش شده است. این بیماری دارای خسارات عمده و چشمگیری در استان بوشهر و بویژه مناطق برازجان، کنگان و بنداروز می­باشد (رئوفی و همکاران 1389). بررسیهای سالهای 1387 و1388 نشان داد که این بیماری در اکثر مزارع بادنجان استان بوشهر وجود دارد. با توجه به علائم ناشی از مایه زنی عامل بیماری تورم جوانه بادنجان به گیاه پروانش و مقایسه چند شکل طولی قطعات برشی محصول واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR-RFLP) نشان داد که فیتوپلاسماهای عامل تورم جوانه بادنجان در استان بوشهر متنوع است و حداقل به سه گروه تقسیم می­شوند. (رئوفی و همکاران 1389).با توجه به اهمیت بیماری و اینکه ماهیت فیتوپلاسمایی عامل بیماری بویژه از نظر گروهبندی و شباهت و یا تفاوت با فبتوپلاسماهای دیگر در ایران و دنیا مشخص نشده بود، در تحقیق حاضر مطالعات زیر انجام گردید.1- انتقال همزمان عامل جدایه های مختلف بیماری تورم جوانه به پروانش های همسن و مقایسه علائم بیماری در آنها2- تکثیر یک قطعه 1800 جفت بازی از اپرون ار. ان. ای ریبوزومی در آزمون PCR با جفت آغازگر P1/P73- RFLP فیزیکی محصول PCR با آنزیم های Alu I، Hinf I، Hae III و Rsa I4- همسانه سازی و تعیین ترادف محصول PCR5- انجام آنالیز های مختلف مولکولی شامل جستجو با برنامه بلاست، بررسی میزان همولوژی، ترسیم درخت فیلوژنتیکی، RFLP کامپیوتری و در نهایت تعیین موقعیت فیتوپلاسما (فبتوپلاسماهای) عامل تورم جوانه در بین فیتوپلاسماها از نظر گروه های اصلی و زیرگروه ها-1-بادنجان2-1-1-تاریخچه بادنجاناین گیاه بومی آسیا بوده و احتمالا در مناطقی از هندوستان و یا چین کشت می­شده است. در هندوستان کشت این گیاه دارای قدمت تاریخی بالایی می­باشد. و طبق مدارک موجود در قرن پنجم کشت این گیاه در چین مرسوم بوده ولی اروپا قدمت چندانی در کشت این محصول ندارد (Singh et al., 1997 and Splittstosser 1990). به­نظر می رسد که مسلمانان در گسترش این گیاه به اروپا نقش عمده و موثری داشته اند (مبلی و پیراسته 1373).2-1-2- مشخصات گیاه شناسیگیاهی یک­ساله متعلق به نهاندانگان دولپه بوده ولی بسته به شرایط آب و هوایی می تواند بیش از یک سال نیز دوام بیاورد (Halfaere and Barden 1979). این گیاه متعلق به تیرهSolanaceae و با نام علمی Solanum melogenaمی باشد. ساقه این گیاه قوی، خشن و چوبی بوده و ارتفاع آن می­تواند به 60 سانتی متر تا یک متر برسد. برگ های پهن و کشیده آن بصورت متناوب روی ساقه قرار می­گیرد و ممکن است با کرک پوشیده شده باشد. میوه این گیاه قلمی یا کشیده با رنگهای ارغوانی، سیاه، بنفش، بنفش مایل به سیاه و یا سفید است. بهترین دما جهت رشد بادنجان 32-26 درجه سانتی گراد در روز و 26-21 درجه در شب می باشد (Halfare and Baren 1979). این گیاه نسبت به گوجه فرنگی حساسیت بیشتری به سرما دارد (Ware and McCollum 1980).2-1-3-ارقام بادنجان:2-1-3-1- بادنجان پاکوتاه (Dwarf eggplant):نام علمی این واریته Solanum melonena Var. depressumمی­باشد. میوه بسیار کوچک، بنفش رنگ و گلابی شکل است. طول دوره رشد کوتاه می باشد (شیبانی 1367).2-1-3-2-بادنجان قلمی (Snake eggplant):نام علمی این واریته Solanum melogena Var. serpentinum می­باشد. میوه در این نوع بسیار دراز و باریک به طول 30-25 سانتی متر و قطری در حدود 4-3 سانتی متر می­باشد (شیبانی 1367).2-1-3-3-بادنجان معمولی (Common eggplant):نام علمی این واریته Solanum melogena Var. esculentumمی­باشد. ارتفاع بوته در این بادنجان تا 120 سانتی متر نیز می­رسد. طول میوه 4-3 برابر قطر آن می­باشد (شیبانی 1367).2-2-گوجه فرنگی2-2-1-تاریخچهیکی از مهمترین سبزی­های دنیاست. ممکن است بومی آمریکای مرکزی باشد (Halfaere and Barden 1979) ولی برخی منابع موطن آنرا آمریکای جنوبی می دانند (قادری 1353، Halfare and Barden 1979). نام گوجه فرنگی (Tomato) گرفته شده از یک کلمه مکزیکی بنام Tomati می­باشد (Rodale et al., 1977). در ابتدا گوجه فرنگی را یک گیاه زینتی محسوب می­کردند (Nonnecke 1989) و میوه آنرا سمی می­دانستند (Everett 1984). در سال 1956 این گیاه به اروپا انتقال داده شده است (Everett 1984).2-2-2-مشخصات گیاه شناسینام علمی این گیاه Lycopersicum esculentum بوده و به تیره Solanaceae تعلق دارد. این گیاه می تواند در مناطق سردسیر بصورت گیاهی یک ساله و یا در مناطق گرمسیر بصورت گیاهی چند ساله مطرح باشد (Janick 1989 and Gollan 1992). برگها مرکب و ساقه جوان آن پوشیده از کرک های ریز و سفید می­باشد. ساقه در هنگام جوانی گیاه سبز، کرک دار، گرد و خیلی شکننده است. برگ های مرکب بصورت متناوب روی ساقه قرار دارند. گل در این گیاه کامل (Perfect flower) و هر خوشه بین 8-4 گل دارد (Halfaere and Barden 1979). این گیاه به طول دوره روشنایی در روز حساس نبوده ( Nonnecke 1989) ولی چنانچه میزان روشنایی کمتر از 5 ساعت باشد یا اینکه در معرض روشنایی دائم باشد میوه نمی­دهد (Splittstoesser 1990). بهترین دما جهت رشد ونمو این گیاه 29-19 درجه سانتی­گراد می­باشد (Ware and Mccollun 1959) و در دمای بالای 35 درجه رشدش متوقف و میوه تشکیل نمی­شود (Ware and Mccollum 1980) در دمای پایین تر از 15 درجه امکان تلقیح برای گلها وجود ندارد (Nonnecke 1989).2-2-3-ارقام گوجه فرنگیاین گیاه دارای ارقام متفاوتی می­باشد. برخی آنرا براساس زود ، میان و یا دیر رسی تقسیم بندی می­کنند. عده ای بر اساس طول بوته و البته در مواردی خصوصیاتی از جمله مقاومت نسبت به ترکیدگی، همزمان رسیدن میوه ها، مقاوم بودن نسبت به بیماری­ها و... جهت طبقه بندی ارقام مورد استفاده قرار می­گیرد. برخی ارقام آن عبارتند از (شیبانی 1367، قادری 1353):گوجه فرنگی معمولی (Lycopersicum esculentum Var. common)، برگ پهن (Lycopersicum esculentrum Var. grandifolium)، ریز آلبالویی شکل (Lycopersicum esculentum Var. cerasiforme)، گلابی شکل (Lycopersicum esculentum Var. pyriform) و با ساقه محکم و ایستاده (Lycopersicum esculentum Var. validum).2-3- پروکاریوت های سخت کشت آوندیاین گروه از باکتری ها بطور مستقیم بوسیله حشره تغذیه کننده از آوند ها به درون آوند های چوبی یا آبکشی وارد می شوند و برخلاف دیگر باکتری ­ها به فضاهای بین سلولی وارد نمی­شوند. این باکتری ها را می توان بطور کلی به 3 گروه زیر تقسیم نمود.1-باکتری­های بدون دیواره سلولی(مالیکیوت) ساکن آوندهای آبکشی شامل فیتوپلاسماها و اسپیروپلاسماها.2- باکتری های دیواره دار و ساکن آوند های آبکشی: این باکتری­ها عموماً کوچک ومیله­ای شکل با ویژگی باکتری های گرم منفی می باشند. دیواره خارجی در این باکتری­ها حالت مواج دارد و به دلیل این خصوصیت قبلا آنها را تحت عنوان (Rickettsia-like organism (RLO می شناختند (Fletcher and Wayadande 2002). تعداد 24 بیماری از گیاهان تک لپه ای و دو لپه ای شامل گیاهان علفی و درختی، سبزی ها، میوه ها و غلات و گیاهان زینتی ناشی از این میکروارگانیزم ها گزارش شده اند (Davis 2001). تعداد کمی از باکتری های دیواره دار ساکن آوند های آبکشی موقعیت تاکسونومیکی مشخص دارند و در رده Proteobacteriaقرار می گیرند. Candidatus Liberibacter asiaticus وCa. L. africanus به ترتیب عامل بیماری میوه سبز مرکبات در آسیا و آفریقا می باشند که متعلق به این گروه می باشد. اخیرا این باکتری در محیط کشت جدا سازی گردیده است (Sechler et al. 2009). باکتری عامل بیماری زردی حاشیه برگ های توت فرنگی با نام علمیCa. Phlomobacter fragaria نیز در این گروه قرار می گیرد. تعیین موقعیت تاکسونومیک این گروه از باکتریها از طریق تکثیر برخی از نواحی ژنومی از جمله ژن 16S rRNA انجام می گیرد (Fletcher and Wayadande 2002).3- باکتری های سخت کشت ساکن آوندهای چوبی:برخی از باکتری های بیماریزای دیواره­دار ساکن آوندهای چوبی میزبان خود می­باشند و برخی از آنها بوسیله زنجرک­های سر مخروطی (sharpshooters) و سن­ها (spittle bugs) انتقال پیدا می­کنند ولی همه آنها ناقل حشره­ای ندارند مانند Leifsonia xyli subsp. xyli (Raju and Wells 1986). این گروه از باکتری ها بدلیل اینکه به سختی در محیط کشت رشد می کنند سخت کشت (Fastidious) و بدلیل اینکه اینکه دیواره موج دار دارند ریکتسیا مانندrickettsia) like ) نامیده می شوند. با وجود این تعدادی از این باکتری ها قابل کشت می­باشند. دامنه میزبانی در اینها گسترده است و ایجاد بیماری های متنوعی می کنند. یکی از اعضای این گروه، بیمارگر Xylella fastdiosa می باشد که دارای دامنه میزبانی وسیع بوده و در اغلب آنها از نظر اقتصادی مهم می باشد. بیماری پیرس انگور، فونی­هلو، سوختگی برگ خرزهره، سوختگی برگ بادام و چندین درخت جنگلی از جمله بیماری هایی می باشد که توسط این بیمارگر ایجاد می شوند (.(Fletcher and Wayadande 2002 این باکتری X. fastidiosa) ( گرم منفی و میله ای شکل با رشد کند در محیط های خاص می باشد (Hopkins 2001).عامل کوتولگی نیشکر (Leifsonia xyli subsp. xyli) و عامل کوتولگی مرغ (L. x. subsp. cynodontis) دو نمونه از باکتری های گرم مثبت ساکن آوندهای چوبی می باشند. این باکتری ها دارای دامنه میزبانی نسبتاً محدود، واغلب به شکل میله ای خمیده و در محیط مصنوعی دارای رشد کند هستند (Davis and Vidaver 2001).2-4- طبقه بندی مالیکیوت ها2-4-1-توصیف رده مالیکیوت هااعضای این رده باکتری­هایی هستند که بوسیله یک غشاء منفرد پوشیده شده اند، فاقد دیواره سلولی بوده و علاوه بر این توانایی سنتز مواد اولیه از قبیل مورامیک اسید و دی-آمینوپملیک اسید که جزو مواد سازنده دیواره سلولی هستند را ندارند (Martin et al., 1980; Plackett 1959). این گروه از میکروارگانیسم بسیار کوچک بوده که در حالت کروی قطر آنها در محدوده 300 نانومتر می باشد (Boatman 1979). از نظر شکل ظاهری می توانند بصورت کروی، مارپیچ یا رشته ای مشاهده شوند. البته برخی گونه ها حالت پلئومرف (چند شکلی) دارند و ممکن است در حالت رشته ای مسلیوم شکل باشند (Baseman et al., 1982). بر طبق آخرین طبقه بندی، رده مالیکیوت ها در چهار راسته به شرح جدول زیر (جدول 2-1) طبقه بندی شده اند (ICSB 1995).تعداد صفحه :78قیمت : چهارده هزار تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود به شما نشان داده می شود

و به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09124404335        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید