پایان نامه کارشناسی ارشد: شناسایی و تعیین نژادهای ویروس وای سیب زمینی (PVY) بروشهای مولکولی در استان گلستان

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته: مهندسی کشاورزی

گرایش: بیماری­ شناسی گیاهی

عنوان : شناسایی و تعیین نژادهای ویروس وای سیب زمینی (PVY) بروشهای مولکولی در استان گلستان

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد دامغان

پایان­ نامه کارشناسی ارشد رشته مهندسی کشاورزی

گرایش بیماری­ شناسی گیاهی

عنوان:

شناسایی و تعیین نژادهای ویروس وای سیب زمینی (PVY) بروشهای مولکولی در استان گلستان

استاد راهنما :

دکتر سعید نصراله نژاد

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب:

چکیده   1

مقدمه: 4

1-1- سیب زمینی.. 5

1-1-1- تاریخچه سیب زمینی.. 5

1-1-2- گیاه شناسی.. 6

1-1-3- دما : 8

1-1-4- خاک و کود. 9

1-1-5- اهمیت اقتصادی سیب زمینی.. 10

1-2-1- علایم بیماری های ویروسی سیب زمینی.. 11

1-2-2- همه گیرشناسی و چرخه ی بیماری.. 11

1-2-3- کنترل بیماریهای ویروسی سیب زمینی.. 12

1-3- فرضیه ها 12

1-4- اهداف.. 12

فصل دوم. 13

2-1- ویژگیهای گروه پوتی ویروس‏ها 14

2-1-1- ویروس وای سیب زمینی.. 15

2-1-1-1- دامنه میزبانی و علایم ویروس وای سیب زمینی.. 16

2-1-1-2- وضعیت ویروس وای سیب زمینی در ایران. 17

2-1-1-3- ناقلین ویروس وای سیب زمینی.. 18

2-1-1-4-ساختار ژنتیکی.. 19

2-1-1-5-نژادهای ویروس وای سیب زمینی.. 19

2-1-1-5-2- نژاد N.. 20

2-1-1-5-3-نژاد C.. 21

2-1-1-6-روشهای بررسی نژادهای PVY : 21

2-1-1-7-نوترکیبی در ژنوم ویروس y سیب زمینی.. 22

2-1-1-8-مقایسه دو روش رایج شناسایی PVY.. 23

فصل سوم. 26

3-1-نمونه برداری از مزارع سیب زمینی.. 27

3-2- مواد گیاهی.. 28

3-2-1- نگهداری نمونه ها در آزمایشگاه 28

3-3-آزمون آزمون الایزای غیر مستقیم. 29

3-5- انتخاب جدایه های مثبت.. 30

3-6- مطالعات گلخانهای.. 30

3-6-1- آماده سازی گیاهان گلخانهای.. 31

3-6-2- مایه زنی گیاهان گلخانهای.. 31

3-7- روش آزمون RT-PCR.. 33

3-7-1 روش تهیه cDNA.. 33

3-7-3 مراحل به دام اندازی RNA ویروس… 34

3-9- انجام واکنش PCR.. 35

3-9-1- طراحی پرایمر. 35

3-9-2 روش آزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) 36

3-10 روش تهیه ی ژل و انجام الکتروفورز برای بررسی نتایج آزمون PCR.. 37

3-11- مقایسه توالی نوکلئوتیدی نژادهای  PVYبا توالی مشابه در سایر جدایه های موجود در بانک ژن. 38

فصل چهارم: 42

4-1- منبع ویروس… 43

4-2- نتایج آزمون الایزای غیر مستقیم. 44

4-3 مطالعات گلخانه ای.. 46

4-5- نتایج آزمون RT-PCR.. 47

4-6- تنوع ژنتیکی.. 52

4-7- بیشترین درصد تشابه جدایه های مورد بررسی با نژادهای اصلی PVY در جهان : 52

4-7- مقایسه نتایج حاصله از آزمونهای الایزای غیرمستقیم و RT-PCR.. 54

فصل پنجم. 55

5-1- بررسی نوترکیبی در  ایزولههای ایرانی ویروس Y سیب زمینی: 58

5-2- پیشنهادات اجرایی و پژوهشی.. 59

فهرست منابع و ماخذ. 61

منابع انگلیسی: 64

فهرست جداول

جدول شماره­ی 3-1- مواد لازم در مخلوط واکنش ترانویسی معکوس (RT)……………………………………….44

جدول 3-2- توالی و موقعیت آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق…………………………………………………………45

جدول شماره­ی 3-3- مواد لازم در واکنش PCR…………………………………………………………………………….46

جدول شماره­ی 3-4- چرخه­­ی دمایی آزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز………………………………………………47

جدول 3-5- مواد لازم و مقدار هر یک از آنها برای تهیه محلول پایه PCR………………………………………………….47

جدول3-6 جدابه­های ویروس وای سیب­زمینی که CP آنها مقایسه شده است………………………………………………49

جدول 4-1- فراوانی ویروس Y سیب زمینی در کل نمونه­ها به تفکیک منطقه نمونه برداری…………………………..55

فهرست اشکال

شکل 2-1- الف- ساختار فیزیکی (رشته­ای خمش­پذیر) (بی­نام، 2009). ب- تصویر شماتیک از اجزاء ژنوم PVY………………………………………………………………………………………………………………………………………….26

شکل3-1- علائم ویروس Y سیب زمینی برروی سیب زمینی( الف-نکروز رگبرگ، ب-روشنی رگبرگ)……………………………………………………………………………………………………………………………………..38

شکل 3-3- مرحله کاشت گیاهان گلخانه­ای……………………………………………………………………………………43

شکل 4-1- موزاییک و زردی ایجاد شده توسط ویروس Y سیب زمینی……………………………………………..53

شکل 4-2- علائم موزائیک در اثر PVY بر روی برگ سیب زمینی…………………………………………………….53

شکل 4-3- علائم ایجاد رگبرگ روشنی ونکروتیک بوسیله ویروس Y سیب زمینی بر روی سیب زمینی..54

شکل 4-4 نتایج تست سرولوژیک نمونه های آلوده به pvy  درسطح مناطق مختلف استان…………………..55

شکل 4-5- نکروز و موزائیک برروی گیاه توتون رقم سامسون بوسیله تلقیح PVY……………………………..56

شکل 4-6- ایجاد موزائیک و بوسیله ویروس Y سیب زمینی…………………………………………………………….57

شکل 4-7- ایجاد نکروز رگبرگ بوسیله PVY ……………………………………………………………………………….57

شکل 4-8- نتایج آزمون PCR در ژل آگارز 1% با بافر TBE. سمت چپ: مارکر DNA. چاهک  آلوده به PVY. قطعه ای به اندازه 990 نوکلئوتید تکثیر شده است…………………………………………………………………..58

شکل4-9- دندروگرام (درخت­واره) حاصل از گروهبندی ایزوله­های توالی­یابی شده در این آزمایش به همراه ایزوله­ها و استرین­های ایرانی موجود در بانک ژن که به روش Parsimony Maximum-در نرم افزار MEGA5 به دست آمده است……………………………………………………………………………………………….59

شکل4-10- دندروگرام (درخت­واره) حاصل از گروهبندی ایزوله­های توالی­یابی شده در این آزمایش به همراه ایزوله­ها و استرین­های ایرانی و جهان موجود در بانک ژن که به روش Parsimony Maximum-در نرم افزار MEGA5 به دست آمده است……………………………………………………………………………………..60

شکل 4-11- جدول بیشترین درصد تشابه جدایه­های مورد بررسی با نژادهای اصلی PVY در دنیا…………63

 

چکیده
یکی از عوامل محدود کننده کشت سیب زمینی در استان گلستان، بیماریهای گیاهی میباشند که مهمترین آن ویروسها می باشند و در بین آنها، ویروس PVY) Potato virus Y )از مخربترین آنها میباشد. این ویروس بسیاری از   گونه های خانواده سولاناسه به علاوه بیش از 60 گونه گیاهی دیگر را آلوده می کند. علائم این ویروس برحسب استرین و رقم سیب زمینی کاملاً متفاوت است. به طور کلی PVY دارای سه نژادPVYN, PVYC, PVYO در ایران گزارش شد. به منظور تعیین استرینهای این ویروس در سال زراعس 1391 تعداد 170 نمونه از 80 مزرعه سیب زمینی استان گلستان (گالیکش، مینودشت، آزادشهر، رامیان، دلند، قرق، فاضل آباد، علی آباد، گرگان و کردکوی) گرفته شد. نمونه ها  با روش سرولوژیک الیزای غیرمستقیم با آنتی سرم PVY تست شدند، و نمونه هایی که در این تست مثبت بودند روی گیاه محک مایه زنی گردید و قسمتی از این نمونه های مثبت، با کیت Capture mRNA، به دام اندازی RNA ویروس صورت گرفت. RNA به دام افتاده در واکنش رونویسی معکوس تبدیل به cDNA گردبد.، جهت تکثیر cDNAی تولید شده، واکنش PCR انجام شد. محصول نهایی PCR، به منظور تعیین ترادف به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال و تعیین ترادف گردید این ترادفها با ترادف سایر جدایه های PVY موجود در بانک ژن توسط برنامه Clustal X همردیف سازی و مقایسه شد و مشابهت نوکلئوتیدی و آمینو اسیدی بین آنها در برنامه MegAlign  محاسبه شد. درخت فیلوژنتیکی حاصل از همردیف سازی ترادفها توسط برنامه MEGA5 به روش Neighbor-joining با متد Kimura-2 بدست آمد و به وسیله نرم افزار Treeview ارزیابی شد. نتایج این تحقیق نشان داد که از بین 170 نمونه، تعداد نمونه آلوده به ویروس بودند که سه نژاد PVYN, , PVYO ،PVYWilga برای اولین بار در این استان روی میزبان مذکور گزارش می شود. همچنین آنالیزهای فیلوژنتیک ناحیه CP جدایه های مورد بررسی در این تحقیق نشان داد که نژاد  PVYN با 03/64 درصد پراکنش به عنوان نژاد غالب در مزارع سیب زمینی استان گلستان شیوع داشته اما نژاد PVYC در این استان مشاهده نشد. همچنین نتایج نشان داد که منطقه کردکوی با 54.8 درصد فراوانی آلودگی بیشترین میزان آلودگی را به PVY در بین مناطق دیگر در سال زراعی 91 نشان داد. نتایج مقایسه ترادف ناحیه ژن پروتئین پوششی نشان داد که جدایه های گرگان و آزادشهر شباهت بیشتری (99تا97درصد) به یکدیگر داشتند اما جدایه مینودشت، گالیکش، کردکوی در زیر گروه علی آباد قرار گرفته اند. جدایه های گزارش شده از کرمان با جدایه های گلستان هم گروه شده اند که بیانگر رابطه نزدیک فیلوژنتیکی بین آنهاست. به دنبال آن بترتیب جدایه های خراسان، اصفهان، اردبیل، ، شیراز (نژاد بوشهر) نزدیک تر بوده اند. جدایه های زنجان و اردبیل در گروه جداگانه ای قرار گرفته اند که دارای شباهت بیشتری به جدایه ای از اردبیل ارزیابی شده است. در دندروگرام مربوط به مقایسات جدایه های ایران با سایر کشورهای دنیا نتایج نشان داد که جدایه های گلستان با جدایه های کرمان هم گروه بوده، که شباهت نزد یکی با جدایه های آلمان، کانادا و آمریکا داشته اند. که بیانگر رابطه ژنتیکی بالا(94% شباهت ژنتیکی) می‌باشد. همچنین نتایج  نشان داد که تنوع ژنتیکی بین جدائیه ها که با روش حداکثر درستنمایی1 در نرم افزار BioEdit نسبت جایگزینی انتقالی به جایگزینی متقاطع2 به دست آمد برابر 08/1می باشد. بنابراین می توان گفت جهش های صورت گرفته در ژنوم ویروس مذکور از روند مشخصی پیروی می کند.
 

مقدمه:
ویروس­ها موجوداتی بسیار کوچک و غیر قابل رویت با میکروسکوپهای معمولی (نوری) هستند که تنها در سلول­های زنده تکثیر می یابند. حدود 50 سال قبل، اولین ویروس­ها جدا شده و خصوصیات شیمیایی آنها تعیین گردید. آنها ویروسهای واگیر دار گیاهان بودند. همزمان، بحث­های زیادی در خصوص تعلق این عوامل به دنیای زنده یا غیر زنده مطرح گردید. در خلال 30 سال اخیر، به کمک کاربرد مفاهیم و روش های زیست شناسی مولکولی، کاملا مشخص شده است که ویروس­ها قسمتی از جهان زنده می باشند. در واقع ویروس­ها، انگل­های اجباری بسیار کوچکی هستند که دارای یک تا چند صد ژن می باشند. این ژن­ها مانند ژن­های سلولی می توانند جهش یافته و تکامل یابند ( پوررحیم و همکاران، 1381). خانواده Potyviridae جزو مهمترین گروه­های ویروسی بیماری­زای گیاهی و یکی از بزرگترین آن­ها است .در میان پوتی ویروس­ها[1]، ویروس­وای­سیب­زمینی (PVY)[2] به عنوان یکی از مخربترین بیمارگرهای توتون، سیب زمینی، گوجه فرنگی و فلفل محسوب می­گردد، ). به طوری که در برخی موارد،با توجه به سویه ویروس،رقم سیب زمینی و شرایط آب و هوایی منطقه،ویروس Y سیب زمینی می تواند بین 40-70 درصد خسارت وارد نماید(Beemster&De Bokx. 1987). براساس عکس العمل گیاهان معرف و قدرت انتقال توسط شته ویروس Y سیب زمینی به سه گروه نژادی (PVYo,PVYn, , PVYc) تقسیم شده است(De bokx & Huttinga, 1981). علاوه بر اختلاف در عکس العمل تعدادی از میزبانهای معرف، شته ها دو سویه PVYo  و PVYn را به طریق ناپایا (Nonpersistent) انتقال می دهند، در حالیکه سویه های گروه PVYc با شته منتقل نمی شوند (Beemster & De Bokx, 1987). در سال­های اخیر بیشترین فعالیت های تحقیقاتی در زمینه کنترل بیماری­های ویروسی شامل اصلاح رقم­های ایمن یا مقاوم با روش­های کلاسیک ژنتیکی، کنترل ناقلین با استفاده از راهبرد­های مختلف، تولید بذور و اندام­های رویشی ازدیادی عاری از ویروس و تولید گیاهان تراژنی است که حامل ژن­های ویروسی هستند و موجب بروز مقاومت در برابر ویروس می­گردند (پوررحیم و همکاران، 1381).). اساس هر انتخاب یا برنامه به­نژادی، وجود تنوع ژنتیکی در بین گیاهان یک گونه در واکنش به یک ویروس خاص است و در مورد بسیاری از ویروس­های گیاهی که اهمیت اقتصادی دارند، می­تواند مورد استفاده قرار گیرد (جعفرپور، 1382).

تعداد صفحه : 85

قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09199970560        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

شماره کارت :  6037997263131360 بانک ملی به نام محمد علی رودسرابی

11

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید