پایان نامه : کلونینگ و بیان ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز باکتری E. coli جهش یافته و مقایسۀ خواص این آنزیم با نوع native آن

دانلود متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی

گرایش : میکروبیولوژی

عنوان : کلونینگ و بیان ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز باکتری  E. coli  جهش یافته و مقایسۀ خواص این آنزیم با نوع native آن

دانشگاه آزاد اسلامی   

واحد کرج

دانشکده علوم،گروه میکروبیولوژی

                   پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد(M.Sc.)

                                    گرایش میکروبیولوژی

عنوان :

کلونینگ و بیان ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز باکتری  E. coli  جهش یافته و مقایسۀ

خواص این آنزیم با نوع native آن

                                          استاد راهنما

                                  خانم دکتر مهروز دزفولیان

                                          استاد مشاور

                                   آقای دکتر ناصر هرزندی

                                          تابستان 90

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)فهرستچکیده ........................................................................................................................................................ 1مقدمه ...........................................................................................................................................................3فصل اول کلیات .................................................................................................................... 51-1-پیشینه تاریخی ................................................................................................................................... 61-2-آماده سازی ال-آسپاراژیناز قابل استفاده برای درمان ........................................................................ 81-3-  آزمایش های بالینی با ال-آسپاراژیناز ............................................................................................ 101-4-خصوصیات شیمیایی و داروشناسی این دارو .................................................................................. 121-4-1  اثر ضد سرطانی .......................................................................................................................... 121-4-2- ترکیبات شیمیایی داروی در دسترس برای درمان ..................................................................... 141-4-2-1 آنزیم طبیعی ............................................................................................................................ 141-4-2-2-آنزیم تغییریافته ...................................................................................................................... 161-5- فارماکوکنتیک ................................................................................................................................ 191-5-1- مقاومت دارویی ........................................................................................................................ 231-5-2-  تأثیر دارویی .......................................................................................................................... 251-6-سمیّت .......................................................................................................................................... 28فصل دوم روش کار ......................................................................................................... 342-1- مواد و میکروارگانیسم ها .............................................................................................................352-2- کشت باکتری .............................................................................................................................. 352-3- اعمالUV  در زمان های مختلف ................................................................................................ 352-4- انجام تست Nesslerization به منظور بررسی مقدار آمونیاک آزاد شده ............................... 362-4-1- کشت کلنی ها ....................................................................................................................... 362-4-2- تعیین غلظت آمونیاک آزاد شده در محلول واکنش توسط ال-آسپاراژیناز کلنی ها ............... 372-4-3- محلول های لازم برای سنجش میزان فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز کلنی ها ......................... 382-5- استخراج  DNA......................................................................................................................... 402-5-1- کشت باکتری به منظور استخراج  DNA................................................................................ 402-5-2- استخراج DNA ژنومی .......................................................................................................... 412-6- واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR)   ........................................................................................... 422-7- الکتروفورز بر روی ژل آگارز ................................................................................................. 432-8- خالص سازی محصول PCR .................................................................................................. 442-9- استخراج پلاسمید ................................................................................................................... 462-10- هضم آنزیمی و کلون کردن قطعه در داخل وکتور ............................................................... 472-10-1- الگوی برش آنزیمی ژن ال-آسپاراژیناز ll ....................................................................... 472-10-2- برش و آماده سازی وکتور pET23a(+) ........................................................................ 482-10-3- واکنش الحاق وکتور pET23a(+) با قطعه ژنی ال-آسپاراژینازll  .................................. 482-11-ایجاد سلول های Competant و انتقال پلاسمید .............................................................. 492-12-انتخاب کلون های مثبت ....................................................................................................... 502-13- تأیید کلنی های نوترکیب با PCR و هضم آنزیمی .............................................................. 512-13-1-PCR ................................................................................................................................ 512-13-2- هضم آنزیمی ................................................................................................................... 522-14- بیان و استخراج پروتئین بیان شونده توسط ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll ............................... 532-14-1- القاء بیان پروتئین آنزیمی ال-آسپاراژیناز  ll..................................................................... 532-14-2- استخراج پروتئین های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll  و ال-آسپاراژیناز l .............................. 542-15- بررسی اولیه بیان پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز ll و پروتئین ال-آسپاراژیناز l با SDS-PAGE  ............................................................................................................................................. 552-16- تعیین فعالیت آنزیمی یا فعالیت کلّی( IU ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ............................... 582-17- تعیین پروتئین کلّی ( mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ........................................................ 592-18- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg )  آنزیم های ال-آسپاراژیناز  .................................................. 622-19- کشت سلول انسانی  ............................................................................................................. 622-19-1- تهیه محیط کشت RPMI1640 ..................................................................................... 63 2-20- تاثیر آنزیم ال-آسپاراژیناز ll (نوترکیب)،ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی انسانی  ............................................................................................................................... 632-20-1- MTT Assay ................................................................................................................ 632-21- تست تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ........................ 65فصل سوم نتایج ........................................................................................................... 673-1- بررسی و شماره گذاری کلنی ها ........................................................................................... 683-2- نتایج اعداد جذب محلول های استاندارد سولفات آمونیوم در طول موج nm490 ............... 693-3- بررسی اعداد جذب آمونیاک آزاد شده در محلول های به دست آمده از کلنی های جهشیافته ................................................................................................................................................ 703-4- جداسازی و تکثیر ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll  ...................................................................... 723-5- تعیین توالی قطعه ژنی l-aspsraginase ll  ....................................................................... 743-6- وارد کردن قطعه ژنی l-asparaginase ll  در وکتور pET23a و تأیید آن ...................... 763-7- نتیجه SDS-PAGE نمونه های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll , l و استاندارد .............................. 793-8- محاسبۀ فعالیت آنزیمی(IU)  ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژینازاستاندارد ......................................................................................................................................... 803-9- تعیین پروتئین کلّی (mg) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد ........................................................................................................................ 823-10- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg )  آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl وال-آسپاراژیناز استاندارد ................................................................................................................. 843-11- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلولهای سرطانی HeLa  ...................................................................................................................... 853-12- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلولهای سرطانی LCL   ....................................................................................................................... 893-13- بررسی تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ..................... 97فصل چهارم بحث و پیشنهادات .................................................................................. 98  منابع ............................................................................................................................................... 108     چکیدهال- آسپاراژیناز آنزیمی است که موجب هیدرولیز آسپاراژین به اسید آسپاراتیک و آمونیاک می شود . نام دیگر آن ال-آسپار است . این آنزیم امروزه جهت درمان بیماری سرطان خون و برخی تومور ها استفاده می شود. بطور کلی سلولهای سرطانی قادر به سنتز اسید آمینه غیر ضروری آسپاراژین نیستند در حالی که سلولهای نرمال خودشان این اسید آمینه را می سازند لذا سلولهای سرطانی نیازمند به مقادیر بالا از آسپاراژین در حال گردش می باشند . ال- آسپاراژیناز با تجزیۀ ال-آسپاراژین مانع از دسترسی سلولهای سرطانی به منابع این اسیدآمینه می شود . مهمترین اثر جانبی این دارو حالت آلرژی یا واکنش افزایش حساسیت است . هدف ما از این تحقیق 1- تهیه پروتئین آنزیم ال-آسپاراژیناز از باکتری جهش یافته E. coli  . 2- تاثیر این پروتئین بر روی یک رده سلولی سرطانی به منظور ارزیابی فعالیت آن و 3- دستیابی به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر ، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر بوده است. لذا به منظور رسیدن به اهداف فوق مراحل آزمایشگاهی زیر انجام شد: 1- قرار دادن باکتری E. coli در معرض نور UV . 2- تخلیص  DNA و انجام PCR به منظور تکثیر ژن آنزیم. 3- قرار دادن سکانس در داخل پلاسمید  pET23a(+)  و انتقال به E. coli. 4- خالص سازی پروتئین و تعیین مقدار آن. 5-  تاثیر بر روی یک لاین سرطانی و تعیین مقدار تاثیر آن. به این ترتیب بعد از ایجاد جهش و سنجش میزان تولید و فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز در کلنی های جهش یافته و تخلیص و تکثیر ژن این آنزیم از باکتری هایی که ال-آسپار را بیش از حد معمول تولید می کردند، محصول PCR این ژن ها برای تعیین توالی ارسال گردید و پس از تعیین توالی و مطابقت با بانک ژن بین المللی ncbi ، سکانس قطعه ژنی ال-آسپاراژیناز II  از باکتری E. coli KIAU B1 به عنوان یک سکانس جدید در بانک ژن با کدGenBank: HQ116626.1  به ثبت رسید. ژن مذکور در وکتورpET23a(+)   کلون و سپس پلاسمید نوترکیب حاصل در سلول های E. coli BL21 ترانسفر شد. . از سلول های ترانسفر شده ،پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز استخراج شد و پس از سنجش این پروتئین آنزیمی با تست های نسلریزاسیون و برادفورد، میزان فعالیت آنزیمی(IU)  و پروتئین کلّی(mg) آن مشخص و با نمونۀ استاندارد مقایسه شد. همچنین از نظر تأثیر بر سلول های سرطانی HeLa و LCL  ، با نوع استاندارد قیاس شد. نتایج نشان داد که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز نوترکیب برابر باIU/mg  178 می باشد، در حالی که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز استانداردIU/mgr  77 به دست آمد. همچنین، آنزیم نوترکیب علاوه بر آن که از نظر سکانس و قدرت آنزیمی با نوع استاندارد تفاوت  نشان می دهد ، نسبت به آن به نحو موثرتری بر رده های سلولی سرطانی  HeLa و LCL  تاثیر می گذارد.   مقدمهبا توجه به شیوع روز افزون انواع سرطان به عنوان یکی از مهمترین بیماری های تهدید کنندۀ سلامت انسان، دستیابی به روش های موثرتر در درمان سرطان به ویژه انتخاب ترکیبات دارویی با عوارض جانبی کمتر بیش از گذشته مورد توجه محققین قرار گرفته است.آنزیم ال-آسپاراژیناز به صورت اختصاصی اسیدآمینه ال-آسپاراژین را به ال-آسپارتات و آمونیاک کاتالیز کرده و نقش مهمی را در متابولیسم همه ارگانیسم های زنده و نیز در داروشناسی بازی می کند(2). دو نوع ترکیب از ال-آسپاراژیناز وجود دارد : ال-آسپاراژیناز l، یک آنزیمconstitutive  داخلی، و ال-آسپاراژیناز ll، یک آنزیم خارجی می باشد. این دو آنزیم از لحاظ بیوشیمیایی و ساختار ژنتیکی متفاوتند. ال-آسپاراژیناز ll به صورت گسترده در سلول های پروکاریوتی و یوکاریوتی وجود دارد و بیش از پنج دهه مورد مطالعه فراوان قرار گرفته است(66). این آنزیم از منابع گوناگون مانند سلول های گیاهی و حیوانی، قارچ ها، مخمرها و باکتری ها جدا شده است(61).ال-آسپاراژینازll  یک عامل شیمی درمانی مهم می باشد که برای درمان نوعی از اختلالات لنفوپرولیفراتیو و لنفوما، به ویژه لوکمی لنفوبلاستیک حاد یا ALL[1] بکار برده می شود. این آنزیم بخش اصلی ترکیب پروتوکل های شیمی درمانی است که در درمان ALL  اطفال به مدت تقریباً 30  سال استفاده می شود (6،5،4،3،2،1). بر این اساس، همچنین این آنزیم در جدیدترین رژیم های درمانی چند عاملی برای ALL  بالغین قرار دارد (8،7). ال-آسپاراژیناز به عنوان یک دارو، اثربخشی خود را در درمان و مراحل بعدی استراتژی های مختلف شیمی درمانی اثبات کرده است. بزرگ ترین محدودیت استفاده از ال-آسپاراژیناز حساسیت شدید بالینی در دز اثر بخشی است، که در 78-3 درصد بیماران تحت درمان با فرم های اصلاح نشده آنزیم ظاهر می شود (11،10،9،3). با گذشت بیش از 10 سال به نظر می رسد پگ-ال-آسپاراژیناز به عنوان یک ترکیب جانشین برای ال-آسپاراژیناز ، مشکلات ناشی از انواع ترکیبات طبیعی را اصلاح کرده است (13،12). در این تحقیق سعی بر این شد تا با ایجاد جهش در باکتریKIAU  E. coli ، ارزیابی میزان تولید آنزیم ال-آسپاراژینازll  در سویه جهش یافته، و دستیابی به ترتیب توالی جدید در ژن این آنزیم و کلون کردن آن، بتوان ال-آسپاراژینازی استخراج کرد که از نظر فعالیت ویژه و اختصاصیت در سطح بالاتری نسبت به نوع استاندارد قرار داشته باشد. همچنین با تاثیر این پروتئین آنزیمی بر رده سلولی سرطانی و ارزیابی فعالیت و درصد کشندگی آن بر این سلول ها، بتوان به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر دست یافت.[1] Acute lymphoblastic leukemia تعداد صفحه : 125قیمت : 14000تومان

بلافاصله پس از پرداخت ، لینک دانلود پایان نامه به شما نشان داده می شود

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        09309714541 (فقط پیامک)        info@arshadha.ir

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  -- --

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید